我国水牛繁殖生物技术研究进展

李婥 杨春艳尚江华 郑海英 黄芬香

（中国农业科学院广西水牛研究所，农业部（广西）水牛遗传繁育重点实验室 530001）

我国水牛繁殖生物技术研究进展

李婥 杨春艳*尚江华 郑海英 黄芬香

（中国农业科学院广西水牛研究所，农业部（广西）水牛遗传繁育重点实验室 530001）

水牛适应和抗病力性强、耐高温高湿、耐粗饲、易饲养、使用年限长，非常适合我国南方的饲料资源和气候条件，而且水牛奶营养丰富，现今我国正致力于发展水牛奶业。引入的河流型水牛，体格大，生长快速，产奶量高，与本地水牛杂交后代的奶水牛产奶量达到1200～2000kg，可显著提高本地水牛的产奶性能。但由于水牛的繁殖性能低下，我国水牛杂交改良面临着良种种源匮乏的问题，要突破这个瓶颈，必须集成现代动物繁殖技术（如人工授精、超数排卵、体外胚胎生产、核移植、转基因和胚胎移植等技术），以提高水牛的繁殖效率和种源供应能力，从而促进我国水牛品种改良和水牛奶业开发。近年来，围绕水牛繁殖生物技术已开展了大量的研究，下面就此作一综述。

1 超数排卵和同期发情

一般母牛每次发情只排一个卵。人们通过使用外源激素，能使母牛一次排多个卵以生产多个胚胎，并通过胚胎移植加快优良母畜基因型的扩散。水牛卵巢上原始卵泡数分别比奶牛低30%，卵泡闭锁率较奶牛高，且水牛对超排药物的反应力低，个体反应差异大，因此胚胎回收率远低于奶牛。近年来，水牛的胚胎回收率虽已有很大提高，可用胚胎可高达2.5～3.0枚，但大多数仍在1.0～2.0枚范围内。

常用于水牛超排的促性腺激素有PMSG（孕马血清促性腺激素）和FSH（促卵胞素）。PMSG和FSH用于水牛超排处理的反应已有很多试验研究，几乎所有的实验结果都表明FSH（总剂量为30～50mg）的超排效果优于PMSG（总剂量为2000～3000国际单位），每次超排获得有效胚胎的数量是2.09比0.56[1-2]。

同期发情技术可便于掌握适时输精，缩短发情配种时间，有利于提高人工授精配种受胎率和胚胎移植受胎率。近年来，国内对水牛同期发情技术的应用做了一些研究，已发展了多种同期发情方法用于诱导水牛的发情和排卵，如孕酮法、两次PGF2α法等。研究表明通常有优势卵泡和黄体存在时处理成功率较高；在繁殖季节同期发情的效果较好；在乏情季节，结合使用孕酮可提高受胎率。

蒋如明等（2003）应用孕酮阴道栓结合氯前列烯醇（CIDR+PGc）诱导本地母水牛同期发情，同期发情率高达85.13%，单独应用氯前列烯醇（PGc）或孕酮阴道栓（CIDR），同期发情率也分别达到64.18%、73.01%。而和占星等（2005）运用国产氯前列烯醇处理云南水牛的胚胎移植试验时，供、受体的同期发情率均较低，只有43.33%。

2 水牛胚胎体外生产

胚胎体外生产（Invitroproduction，IVP）包括卵母细胞体外成熟（Invitromaturation，IVM）、 体外受精（Invitrofertilization，IVF） 和体外胚胎培养（Invitroculture，IVC)。通过IVP可大量生产良种胚胎，是解决水牛品种改良过程中胚胎来源困难的一条有效途径。Madan等1991年获得世界上第一头体外受精水牛犊，我国于1993年获得第一头体外受精水牛犊。

胚胎体外生产的卵母细胞来源主要分为屠宰场卵巢和活体采卵（Ovumpick-up，OPU）。屠宰场卵巢容易获得，但由于系谱不明确，且绝大部分为沼泽型水牛卵巢，因此对水牛品种改良的意义不大。OPU通过B型超声波引导，经子宫壁采集卵母细胞，可重复从遗传价值高的水牛采集卵母细胞，其与体外受精技术相结合可生产大量系谱明确的胚胎，从而充分利用优良母畜的遗传潜力。OPU与体外胚胎生产技术相结合，生产的可移植胚胎为超数排卵的2～3倍，每头供体每月可生产更多的可移植胚胎（2.0±0.6枚），并可克服母畜生殖道疾病对胚胎质量的影响[3-6]。

近二十年来，水牛体外胚胎生产取得了较大的进步，但生产效率仍然较低。国内所报道的水牛卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率分别为51.7～80%、52.7～60%和18.5～28.8%。关于水牛活体采卵-胚胎体外生产目前主要在广西水牛研究所开展，黄右军等（2004）经活体采卵平均每头次获可用卵母细胞3.18±2.89枚，采集的可用卵母细胞以MC和SOF两种系统培养，受精分裂率和囊胚率分别为45.2%、30.6%和70.8%、18.8%[6]。黄芬香等（2009）比较了不同季节的活采效果，发现季节之间卵母细胞可用率和受精卵分裂率没有差异，但秋冬季的囊胚率（27.09%）则明显高于春季的20.95%和夏季的20.45%[5]。

水牛的成熟培养系统一般为含10%FBS的TCM199液中添加促性腺激素FSH、LH、类固醇激素E2、表皮生长因子（EGF）和硫醇类化合物β-巯基乙醇。水牛体外受精液中多添加肝素和咖啡因，而王启胜等（2001）在受精液和早期胚胎培养液中添加输卵管上皮细胞+颗粒细胞或牛磺酸，囊胚率分别为28.1%和20%，均极显著高于对照组。水牛受精卵的体外囊胚发育率在多数实验中都只达15～30%，在培养水牛胚胎时除了少数研究使用化学成分明确的培养基外，大多数仍采用含有血清和体细胞的复杂培养液，并发现饲养层细胞有助于促进胚胎越过8～l6细胞期阻滞。在胚胎培养液中加入IGF-l、胰岛素、重组BSA、EGF和ITS可提高囊胚发育率 [7]。

3 水牛胚胎移植

胚胎移植是水牛超数排卵、体外受精、体细胞核移植的最终环节，对良种水牛的扩繁具有重要意义。胚胎移植首先要解决供体母牛与受体母牛发情同期化问题，常用的方法与供体母牛情期同期化处理基本一样，受体母牛注射两次PG或其衍生物，使注射间隔时间l1d。由于水牛黄体突出表面不明显，难以触诊，给胚胎移植准确到位造成一定困难。母水牛子宫颈在发情后不久就处于基本闭锁状态，使输胚管插入困难并容易造成子宫损伤，影响胚移受胎率。为了提高受胎率，选用已产2胎以上的母牛作为受体母牛较好[8]。

目前水牛鲜胚移植受胎率一般只有6～l3%，个别试验受胎率达到33.7～66.7%，胚移受孕水牛3个月内流产比较严重，流产率有时达到40～50%。黄右军等（2002）由2头经超数排卵处理的母水牛，授精后第5d非手术回收3枚囊胚，说明受精卵在体外发育速度比在体内发育慢，推测试管水牛胚胎移植的适宜时间，应是受体母牛站立发情后第4～6d。黄右军等（2004）在受体母牛发情后第4～6d进行胚胎移植，结果鲜胚受胎率：第4d为48.1%，第5d为28.0%，第6d为31.3%，平均为36.2%，说明在此段时间移植6～8d的体外胚胎（囊胚）是适宜的。以每头次2枚体外胚胎（鲜胚或冻胚）移植受体母牛，鲜胚移植受胎率为36.2%，产下21头试管水牛；冻胚移植受胎率为20.0%，产下3头冻胚试管水牛[8]。

4 水牛胚胎冷冻

胚胎冷冻技术可突破时间和空间的限制，解决胚胎生产与移植在时间和地域方面的矛盾，实现水牛胚胎本地生产异地移植，还可长时间保存优良种水牛的遗传资源，便于胚胎运输，促进水牛繁殖生物技术的推广应用。1990年，Misra首次采用程序化冷冻获得了水牛冻胚移植成功。在我国，石德顺等于1999年成功获得首例受精卵冷冻保存的试管牛。张秀芳等（2007）采用甘油对体外受精胚胎进行程序化冷冻，解冻后冻胚成活率达到了73.4～75.0%[6]。

尽管以上研究已验证了水牛胚胎冷冻的可行性，但水牛胚胎的冷冻还没得到广泛的应用。

5 水牛性别控制

使用性别控制技术进行繁育奶水牛的效率将比无性别控制的提高近一倍，对加速繁殖良种水牛，解决制约我国水牛奶业的发展瓶颈——良种水牛缺乏，推动中国水牛奶业发展具有重大的现实意义。目前，实现家畜性别的人为控制主要有两个途径：一是X精子和Y精子的分离；二是早期胚胎的性别鉴定。

自2004年开始，广西大学专家将牛的精子分离后进行人工授精，产下母水牛的成功率94%，公水牛的成功率是91%。卢克焕等（2006）使用流式细胞分类仪分离X、Y精子，准确率达到90%以上，分离的精子用于体外受精，生产的胚胎移植后产下经XY精子性别控制的雌雄水牛双犊[9]。

关于胚胎的早期性别鉴定，武建中等（2006）报道通过连续多重PCR方法扩增公牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1.715卫星DNA序列，能够有效的对水牛早期胚胎进行性别鉴定[10]。

6 水牛体细胞核移植及转基因研究

体细胞核移植在短期内可大量复制具优良基因的动物个体，并为转基因技术研究提供基础。水牛的体细胞核移植研究开始较晚，石德顺等人于2005年报道了首例水牛体细胞克隆牛犊的诞生[16]。核移植操作复杂，影响因素多，针对水牛体细胞核移植的供体细胞类型、供体细胞处理方法开展了大量的研究，这些研究都表明采用颗粒细胞（囊胚率为9.8～22.5%）和胎儿成纤维细胞（囊胚率为8.7～31.45%）的核移植效率好于耳成纤维细胞（囊胚率为7.0～10.9%）；采用细胞处理可提高核移植效率，最佳处理方法为阿菲迪霉素和血清饥饿联合处理（囊胚率为21.3～31.45%），其效果要好于单独的血清饥饿法（囊胚率为7.6～10.6%）和接触抑制法（囊胚率为 8.7～9.5%）[12-13]。

陆凤花（2005）探讨了电融合参数对水牛体细胞核移植效果的影响，最适宜的电融合参数为100V/mm，15μs，3次电脉冲；将来自一头22岁摩拉公牛耳皮肤成纤维细胞的胚胎移植后，妊娠到第215d[14]。石德顺等（2007）采用阿菲迪霉素和血清饥饿联合处理可有效将体细胞同步于G0/G1期，核移植重构胚的囊胚率为21.3～22.2%；将42枚胚胎移植入21头受体，4头妊娠，产出并存活世界第一头克隆水牛犊 [11]。

转基因技术是基因工程和胚胎工程结合的一门生物技术。转基因动物生产是使用转基因工程技术将选定的目的基因导入动物染色体组，并整合表达和遗传的过程。通过转基因克隆的方法对水牛进行定向遗传改良和研发高效乳腺生物反应器，可解决我国水牛奶业开发面临的水牛繁殖率低和产奶量低等问题，提高水牛的经济价值。

董克家等（2003）构建人FSHβ乳腺定位表达载体Plxin-hFSHβ，通过精子载体法，获得一头转基因水牛犊，并通过T-A克隆和测序分析检测了人FSHβcDNA整合情况。韦精卫等（2008）以含neo和GFP基因双标记的水牛、黄牛胎儿成纤维细胞进行牛转基因体细胞核移植，所构建的重组胚，2-细胞阶段观察不到GFP的表达，4-细胞以后GFP的表达逐渐增强，在囊胚的内细胞团和滋养层细胞均可检测到GFP的表达，将黄牛同种转基因克隆囊胚进行移植，获得1例妊娠；并且异种核移植重组胚中可检测到GFP表达，GFP可作为异种核移植胚胎来源的一种新标记，为下一步的转基因克隆水牛生产奠定基础[15]。

7 存在问题

（1）超数排卵和同期发情的效率仍然较低，需要制订中长期的研究计划，探讨水牛卵泡发生和繁殖内分泌规律，找出有效的发情鉴定方法。体外胚胎生产虽然也取得一些成绩，但实质上仍处于研究阶段，还未能真正应用于生产。今后应降低胚胎体外生产的成本，提高体外成产效率。

（2）水牛胚胎冷冻缺乏系统研究，还未能建立一套适合于水牛的胚胎冷冻程序。

（3）体细胞核移植操作条件要求高，且需要高昂的仪器设备，不能在基层应用，急需建立简单高效的徒手克隆技术体系。

（4）水牛转基因的研究开展较晚，目前研究成果还缺乏。

8 结语

水牛的繁殖受气候和季节的影响大，发情征兆不明显给发情鉴定带来一定困难、发情间隔时间长、受胎率低，这些因素制约着水牛的繁殖力。尽管如此，通过科研人员对水牛繁殖内分泌学的研究，以及对水牛人工授精、胚胎移植、体外受精、胚胎冷冻等生物技术的研究，使水牛繁殖性能的提高呈现了希望。随着幼畜超数排卵技术（Juvenile In Vitro Embryo Transfe，JIVET）、核移植、转基因等新兴生物技术在水牛上的研究，相信将来水牛的遗传潜力会得到更好的发掘，水牛奶业也将得到快速发展。

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广西自然科学基金（2013GXNSFBO018045）。

李婥（1979-），女，广西人，学士，实习研究员。

*通讯作者：杨春艳（1972-），女，副研究员，研究方向：主要从事动物遗传育种与繁殖研究。