液相色谱-串联质谱法快速测定果蔬中16 种新型酰胺类杀菌剂残留量

（宁波市农业科学研究院 农业部农产品质量安全风险评估实验室（宁波），浙江 宁波 315040）

液相色谱-串联质谱法快速测定果蔬中16 种新型酰胺类杀菌剂残留量

孙亚米，吕 燕，吴银良*

（宁波市农业科学研究院 农业部农产品质量安全风险评估实验室（宁波），浙江 宁波 315040）

建立果蔬（白菜、芹菜、草莓和葡萄）中16种新型酰胺类杀菌剂的液相色谱-串联质谱快速分析方法。样品用乙腈提取和氯化钠盐析分层后，上清液直接用0.1%甲酸溶液稀释10倍后进行液相色谱-串联质谱分析。采用Acquity BEH C18色谱柱分离，用0.1%甲酸溶液-乙腈作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子模式电离，多反应监测模式检测，基质校准外标法定量。各物质峰面积与样品质量浓度在2.5×10-4～0.25 mg/L范围内呈良好的线性关系，线性回归系数不低于0.994 9。在添加量0.01～5.0 mg/kg范围内，4种果蔬加标16种杀菌剂的平均添加回收率在85.7%～103.9%范围内，批内相对标准偏差在2.6%～5.2%之间。16种新型酰胺类杀菌剂的检出限为1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg，定量限为3.0×10-4～0.01 mg/kg。该方法能满足果蔬中16种新型酰胺类杀菌剂残留量分析的要求。

液相色谱-串联质谱法；酰胺类杀菌剂；果蔬；残留量

酰胺类杀菌剂是指化学结构中含有酰胺结构的一类杀菌剂。1966年由有利来路公司（现科聚亚公司）成功开发第一个酰胺类杀菌剂萎锈灵以来，该类化合物作为杀菌剂已有近50 a的历史，其代表性品种有甲霜灵、恶霜灵和苯霜灵等[1]。近年来，由于杀菌、防霉效果突出，农药公司推出了一批新型的酰胺类杀菌剂，如噻唑菌胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺和双炔酰菌胺等。虽然该类药物毒性较低，但为了保护公众身体健康，我国最新颁布的GB 2763—2014《食品中农药最大残留限量》规定了苯酰菌胺、氰酰胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺、环酰菌胺、噻呋酰胺、双炔酰菌胺7种新型酰胺类杀菌剂在食品中的残留限量，而目前尚未有同时分析这7种新型杀菌剂残留分析方法的报道，因此建立果蔬中简单准确的新型酰胺类杀菌剂残留量分析方法已是迫在眉睫。

目前，国内外公开报道的关于新型酰胺类杀菌剂分析手段主要有免疫分析法[2-3]、气相色谱法[4-7]、液相色谱法[8-9]、气相色谱-质谱法[10-11]、液相色谱-质谱联用法[12-19]，其中目前报道较多的分析方法为气相色谱-质谱联用法和液相色谱-串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法。然而，这些报道的资料中涉及新型酰胺类杀菌剂通常不超过6种，如崔淑华等[16]建立了果蔬中4种新型酰胺类杀菌剂残留LCMS-MS分析方法，陈小龙等[14]建立了果蔬中6种新型酰胺类杀菌剂的残留量LC-MS-MS分析方法；而同时能分析超过6种新型杀菌剂的分析方法仅见王云凤等[15]建立了的果蔬中10种新型酰胺类杀菌剂LC-MS方法；可目前这些方法均不能同时测定GB 2763—2014规定的7种新型杀菌剂残留量。为满足样品实际测定需要，本研究考虑到LC-MS-MS分析方法具有较好的选择性[20-25]，建立了能同时分析16种新型酰胺类杀菌剂的LC-MS-MS分析方法；同时考虑到7种新型酰胺类杀菌剂限量（0.01～30 mg/kg）较高以及LC-MS-MS对酰胺类杀菌剂分析的高灵敏性和选择性，本研究所建立的方法中前处理非常简单，仅通过乙腈提取后进行稀释即可进样分析。最后通过方法学考察，该方法适用于果蔬中16种新型酰胺类杀菌剂残留量分析需要。

1 材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

白菜、芹菜、草莓和葡萄 市售。

硫硅菌胺、环丙酰亚胺、啶酰菌胺、氰菌胺、环氟酰菌胺、呋吡菌胺、苯酰菌胺、环酰菌胺、氟吡菌胺、双炔酰菌胺、噻唑菌胺、噻酰菌胺、氟吡菌酰胺、噻氟菌胺、联苯吡菌胺和吡噻菌胺标准品 德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈和甲醇均为色谱纯 美国Fisher公司；甲酸（色谱纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司。

Acquity UPLC XevoTMTQ MS液相色谱-串联质谱仪（配置电喷雾离子源） 美国Waters公司；3k15型离心机 德国Sigma公司；Ultra-Tyrrax T25型匀质器德国IKA公司。

1.2方法

1.2.1仪器条件

Acquity BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件：B相在0.5 min内保持20%，然后在3.5 min内线性增加到80%，保持1.5 min，然后在0.1 min内降至20%，保持1.4 min；流速：0.3 mL/min；进样量：10 ☒L；柱温：35℃。

MS条件：电喷雾离子源正离子模式电离；多反应监测；毛细管电压：2.0 kV；萃取锥孔电压：20 V；RF透镜电压：0.5 V；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流速：50 L/h；脱溶剂气流速：1 000 L/h；倍增器电压：650 V；二级碰撞气：氩气；其他条件详见表1。

表1 16 种新型酰胺类杀菌剂的定性、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量Table 1 Qualitative ion pairs, quantitative ion pairs, cone voltages and collision energy of 16 amide fungicides

1.2.2样品处理

准确称取5 g果样品于带盖的聚四氟乙烯离心管中，加入10 mL乙腈，高速匀浆1 min后加2 g氯化钠，剧烈振摇1 min，以5 000 r/min离心3 min，吸取上层有机相0.1 mL与0.1 mL乙腈和0.8 mL 0.1%甲酸溶液混合均匀，过0.22μm滤膜后进行LC-MS-MS分析。

1.2.3线性实验

分别称取10 mg硫硅菌胺等14种标准物质（噻氟菌胺和噻唑菌胺除外）于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度配制成1 000μg/mL的储备液。吸取该标准储备液各1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀释定容得到10 ☒g/mL混合标准工作液。吸取0.5 mL噻氟菌胺标准溶液（10 ☒g/mL）氮气缓慢吹干后加入0.50 mL噻唑菌胺标准溶液（10 ☒g/mL）和上述0.5 mL 14种杀菌剂混合标准工作液混合均匀，即成5 mg/L 16种新型酰胺类杀菌剂混合标准工作液。吸取适量该标准工作溶液与0.1%甲酸溶液稀释成2.5×10-4、1×10-3、2.5×10-3、0.01、0.025、0.10、0.25 mg/L的标准溶液进行LC-MS-MS分析，每一质量浓度进样3次，以标准工作液的质量浓度为横坐标，各物质的定量离子对峰面积为纵坐标，绘制各物质标准曲线。

1.2.4基质标准溶液线性实验

样品经1.2.2节进行提取后，吸取不同体积上清液（200、100、50、25μL）与20μL乙腈配制的系列标准工作液（2.5×10-3、0.01、0.025、0.10、0.25、1.0、2.5 mg/L）、适量乙腈和0.1%甲酸溶液混合均匀，使除吸取200μL上清液配制的溶液外其余2 mL最终溶液中乙腈与水体积比为80∶20，混合溶液过0.22μm滤膜后进行LC-MS-MS分析。以各基质标准工作液的质量浓度为横坐标，各物质的定量离子对峰面积为纵坐标，绘制各物质基质标准曲线。

1.2.5添加回收率实验

本研究进行果蔬样品的添加回收率实验，样品处理同1.2.2节方法，样品中16种新型酰胺类杀菌剂的添加量分别为0.01、0.05、0.5、5.0 mg/kg。

2 结果与分析

2.1仪器条件的建立

本实验研究发现，16种新型酰胺类杀菌剂在反相色谱柱上均有较强的保留，当采用等度洗脱时，为使16种新型酰胺类杀菌剂均能洗脱，流动相中有机相比例较高，导致共流出杂质较多，基质效应较强。因此，本实验采用梯度洗脱的方式进行实验，同时经研究发现，以乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时，同一梯度条件下各物质保留时间均比甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相对较短，总离子流图见图1；同时经研究发现两种流动相条件下基质效应和分离度均没有明显差异。为了既降低基质效应，又尽快完成色谱分析，本研究选择乙腈-0.1%甲酸溶液体系进行梯度洗脱。进行梯度优化时发现，氟吡菌胺、氟吡菌酰胺和噻酰菌胺三者色谱分离较困难，同时硫硅菌胺、氰菌胺、环丙酰亚胺和吡噻菌胺四者色谱分离也较困难，但LC-MS-MS能通过选择离子对进行监测，所以本方法未能对它们进行完全色谱分离，最终优化后的色谱条件详见1.2.1节方法。

酰胺类杀菌剂含有酰胺基团，在酸性条件下较易质子化，本研究利用Intellistart软件对16种新型酰胺类杀菌剂在电喷雾正离子模式下进行了参数选择和优化，得到的定性定量离子对、锥孔电压和碰撞能量详见表1。同时为了提高分析灵敏度，方法中时间窗口分成了4段，分析时进行分段扫描。在上述LC-MS-MS条件下得到的标准溶液、空白样品和添加样品详见图1。从图1可见，该类杀菌剂的峰形均较好，白菜和芹菜的空白样品均未见有明显的干扰峰。

图1 酰胺类杀菌剂总离子流图和定性离子对MRM色谱图Fig.1 Total ion chromatograms of amide fungicides

2.2 前处理方法的建立

崔淑华等[16]研究表明，蔬菜和水果样品用乙腈提取后，采用硫酸镁和氯化钠进行盐析，噻唑菌胺、苯噻菌胺、氟吡菌胺和双炔酰菌胺4种新型酰胺类杀菌剂的回收率均较好。本研究采用5 g样品，分别用10、15 mL和20 mL乙腈进行一次提取时发现，仅采用氯化钠进行盐析条件下所有16种新型酰胺类杀菌剂的提取回收率均超过90%。因此首先采用10 mL乙腈对样品中的杀菌剂进行提取，再用氯化钠进行盐析，然后对盐析后的提取液采用不同稀释配比进行基质效应研究。基质效应研究发现，当将提取液5倍稀释使用时，16种酰胺类杀菌剂在白菜、芹菜、草莓和葡萄4种果蔬提取液中基质效应较小（基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率之比范围在0.8～1.2的分别有11、10、12种和14种。而当提取液采用10倍及以上比例（20倍和40倍）稀释时，除氟吡菌胺外（10倍和20倍稀释时，芹菜基质标准曲线斜率和溶剂标准曲线斜率之比分别为1.27和1.23）其余15种杀菌剂的基质效应均较小。为了兼顾方法灵敏度和降低基质效应，本研究最终采用提取液10倍稀释进行实验。

2.3线性实验结果

根据1.2.3节线性实验结果，对16种新型酰胺类杀菌剂在0.25～250μg/L质量浓度范围内以峰面积（y）对质量浓度（x，μg/L）绘制标准曲线，从表2可知，16种杀菌剂的标准曲线线性均较好，相关系数（R2）均不低于0.994 9，说明本方法适用于16种新型酰胺类杀菌剂残留量的定量分析。

表2 16 种酰胺类杀菌剂的溶剂标准曲线方程和相关系数Table 2 Linear standard curve equations with correlation coefficients for 16 amide fungicides by LC-MS-MS

2.4 方法的检出限、回收率和精密度

按照实验测定步骤，在4种果蔬空白样品中添加16种酰胺类杀菌剂混合标准溶液，每个添加实验3次重复，按1.2.2节进行样品处理，测定加标回收率，考察方法的准确性和可靠性。其中葡萄回收率结果详见表3，添加量为0.01～5.0 mg/kg时，16种杀菌剂的加标回收率在87.6%～102.3%之间，相对标准偏差在2.7%～4.4%之间，完全能够满足残留分析要求。其余3种果蔬菜中16种酰胺类杀菌剂的加标回收率也在85.7%～103.9%之间，相对标准偏差在2.6%～5.2%之间。同时按定性离子对信噪比为3计算该方法对16种酰胺类杀菌剂的检出限为1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg。按定性离子对信噪比为10计算该方法对16种酰胺类杀菌剂的定量限为3.0×10-4～0.01 mg/kg。我国GB 2763—2014中规定了食品中7种新型酰胺类杀菌剂（双炔酰菌胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺、环酰菌胺、苯酰菌胺、噻呋酰胺和氰菌胺）的最高残留限量分别为0.01～25、2～5、0.05～0.5、0.02～30、0.02～15、2～3 mg/kg和1.0 mg/kg，而本法的定量限仅为3.0×10-4～0.01 mg/kg，可见本方法完全能满足实际样品测定的需要。

表3 葡萄中16 种酰胺类杀菌剂的平均回收率和相对标准偏差Table 3 Mean recoveries and relative standard deviation of 16 amide fungicides in grape

2.5 方法应用

利用该方法在2014年对宁波市45个葡萄样品中16种酰胺类杀菌剂进行了残留量测定，结果发现有4个样品有啶酰菌胺，含量范围为0.025～0.19 mg/kg，未检出其余15种新型酰胺类杀菌剂。同时利用该方法检测了2014年9月采自江苏扬州的18个白菜样品和江西南昌的10个芹菜样品，其中白菜样品未检出16种酰胺类杀菌剂，芹菜样品中有1个样品检出啶酰菌胺，含量为0.08 mg/kg，未检出其余15种新型酰胺类杀菌剂。

3 结 论

本实验建立了快速测定果蔬中16种新型酰胺类杀菌剂的多残留LC-MS-MS分析方法。对匀质后的样品，用乙腈提取，再采用氯化钠盐析，经盐析后的提取液直接稀释后进行LC-MS-MS分析。对上述16种杀菌剂，本方法回收率在85.7%～103.9%之间，相对标准偏差在2.6%～5.2%之间，方法检出限在1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg之间，定量限在3.0×10-4～0.01 mg/kg之间。该LC-MS-MS分析方法具有快速、灵敏和准确的特点，完全能够满足现行农产品中16种新型酰胺类杀菌剂残留量的分析要求。

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Fast Simultaneous Determination of Sixteen Novel Amide Fungicides in Vegetables and Fruits by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Yami,LÜYan, WU Yinliang*
(Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agricultural Products (Ningbo), Ministry of Agriculture, Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo 315040, China)

A fast method was developed for simultaneously determining 16 novel amide fungicides in fruits and vegetables using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Samples were extracted with acetonitrile and saltedout by sodium chloride to partition amide fungicides into the upper acetonitrile layer. The upper supernatant was then directly diluted with 0.1%formic acid solution before being analyzed by LC-MS-MS on an Acquity BEH C18column with a mixture of 0.10%formic acid solution (A) and acetonitrile (B) as the mobile phase under gradient elution conditions. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using multiple-reaction monitoring (MRM). The target analytes were quantified by matrix-matched external standard calibration. There was a good linear correlation with calibration coefficients all above 0.994 9 between the peak areas and concentrations of the amide fungicides in the range of 2.5×10-4to 0.25 mg/L. The average recoveries of the 16 compounds in cabbage, celery, strawberry and grape were 85.7%-103.9%, and the intra-assay relative standard deviations (RSDs) were between 2.6%and 5.2%. The limits of quantification (LOQs) of these fungicides varied from 3.0×10-4to 0.01 mg/kg. The proposed method was demonstrated to be suitable for the determination of the 16 amide fungicides in vegetables and fruits.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry; amide fungicides; fruit and vegetables; residue

TS207.3

A

1002-6630（2015）12-0230-07

10.7506/spkx1002-6630-201512044

2014-08-08

宁波市农科教结合项目（2013NK33）；2014年国家农产品质量安全风险评估项目（2014FP11）

孙亚米（1963—），女，农艺师，学士，研究方向为农产品中农药残留分析方法。E-mail：zhangsky001@tom.com

*通信作者：吴银良（1975—），男，教授级高级工程师，博士，研究方向为农产品中农兽药残留分析方法。

E-mail：wupaddyfield@sina.com