酶解-UPLC-MS/MS法同时测定咸鸭蛋黄中的11种胆固醇氧化物

柯星黄百芬吕美玲莫卫民任一平（浙江工业大学化学工程学院,杭州004）（浙江省疾病预防控制中心,杭州005）（安捷伦科技中国有限公司,北京000）

酶解-UPLC-MS/MS法同时测定咸鸭蛋黄中的11种胆固醇氧化物

柯星1黄百芬*E-mail：bfhuang@cdc.zj.cn；movm@zjut.edu.cn2吕美玲3莫卫民*E-mail：bfhuang@cdc.zj.cn；movm@zjut.edu.cn1任一平21（浙江工业大学化学工程学院,杭州310014）2（浙江省疾病预防控制中心,杭州310051）
3（安捷伦科技中国有限公司,北京100102）

建立了酶解-超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时检测咸鸭蛋黄中11种胆固醇氧化物（COPs）的方法。咸鸭蛋黄样品经过脂肪酶37℃酶解,正己烷-乙醚混合液（8∶2,V/V）提取,Silica固相萃取柱净化。采用Waters HSST3柱（100mm×2.1mm,0.3μm）,以0.1％甲酸的水相和甲醇/乙腈（1∶1,V/V）混合液的有机相梯度洗脱,实现了11种COPs的基线分离。以d7-7α-OH-胆固醇为内标,在APCI-MS/MS MRM模式下定量检测。结果表明,11种COPs在对应的20～1200 ng/mL和200～3500 ng/mL线性范围内,相关系数均大于0.996,3个加标水平的回收率在79.3％～104.1％之间,日间RSD在2.0％～12.9％之间；定量限范围在0.08～0.40μg/g之间。本方法具有较好的重复性和准确性,并成功应用于咸鸭蛋黄中的11种COPs含量的分布检测。

胆固醇氧化物；咸鸭蛋黄；酶解；液相色谱串联质谱

1 引 言

胆固醇广泛存在于肉、蛋以及奶制品等动物源性食品中[1],其在光和氧气的作用下易被氧化形成胆固醇氧化产物（COPs）。近年来,由于COPs对人体健康有着不利的影响而受到人们的广泛关注。COPs被证明是诱发动脉硬化症的主要原因,具有潜在的细胞毒性、致突变性及致癌性,且不同结构的COPs有着不同的毒性[2～7]。通常认为,新鲜的食物中COPs的含量较低[8]。但对食物不恰当的储存、烹饪、脱水、油炸、腌制等加工都会促进胆固醇转化为COPs[9～14],咸鸭蛋是中国居民的一种日常食物,咸鸭蛋黄中的COPs含量及其主要异构体分布情况,鲜有文献报道。因此,建立一套能同时分离测定咸鸭蛋黄中COPs异构体的分析方法,对摸清咸鸭蛋黄中COPs的含量及其异构体分布情况具有十分重要的意义。

目前分离检测COPs的方法主要为气相色谱法（GC）和高效液相色谱法（HPLC）。GC具有较高的分辨率[15],但由于COPs的热不稳定性,需通过衍生化来提高热稳定性和挥发性[16～19]。HPLC可在常温条件下分离COPs[20,21],通过紫外或质谱检测,紫外检测器在COPs的检测上有较高的灵敏度,但因COPs的吸收大多在低波段,选择性较差,且胆固醇5α,6α-环氧化物、胆固醇5β,6β-环氧化物和胆甾烷-3,5,6-三醇无紫外吸收,无法用紫外检测。串联质谱法检测 COPs可以降低基质背景,提高灵敏度[15,22]。

样品中的COPs含量低,易转化,在样品前处理过程中需要将COPs从脂质组分中选择性分离、纯化和富集,须防止人为产生COPs或导致其相互转化[8,23～25]。目前主要的前处理方法有脂质提取后过固相萃取柱法[26]和皂化提取后过固相萃取柱法[22]。脂质提取后过固相萃取柱法不需要在碱性条件下加热,可避免胆固醇的人为转化,但因不能测定酯化的胆固醇氧化物而致样品中的总COPs含量被低估[27]。皂化法可将酯化的COPs释放出来,提取后通过固相萃取柱纯化,但在强碱性介质中,7-酮基胆固醇易降解为胆甾-3,5-二烯-酮[24],无法保证7-酮基胆固醇的绝对回收率。

本研究建立了一种以酶解法串联固相萃取柱为前处理,超高效液相色谱分离,APCI源串联三重四级杆质谱检测,同位素内标法同时定量咸鸭蛋黄中的11种胆固醇氧化物（COPs）的方法。并将本研究建立的前处理方法与直接提取法及皂化法进行了比较。研究发现,酶解法通过脂肪酶的酶解作用,达到了水解脂质同时释放酯化COPs的目的,并且由于反应在弱碱性的磷酸盐缓冲液中进行,7-酮基胆固醇得到保护,未被降解。因此本方法与皂化法和直接提取法相比,具有提取率高,重复性好等优点。本研究在咸鸭蛋中检出了7α-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、胆固醇5α,6α-环氧化物、胆固醇5β,6β-环氧化物和胆甾烷-3,5,6-三醇等7种COPs,在咸鸭蛋中未检出22R-羟基胆固醇、20α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇和22S-羟基胆固醇。本研究同时监测了鸭蛋腌制过程中COPs的含量变化情况,发现COPs总含量呈先上升后下降的趋势,在15天时总含量达到最高。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪和6460三重四级杆质谱仪（美国Agilent公司）；高速离心机（美国Beckman公司）；超纯水机（美国Millipore System公司）。

20α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、19R-羟基胆固醇、22R-羟基胆固醇、22S-羟基胆固醇、胆甾烷-3,5, 6-三醇,7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、胆固醇5α,6α-环氧化物、胆固醇5β,6β-环氧化物、7-酮基胆固醇标准品和d7-7α-羟基胆固醇同位素内标,均购自Sigma公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、乙醚和甲酸（HPLC级,美国TEDIA公司）；硅胶固相萃取柱（500 mg,Waters公司）,脂肪酶（活力为800 U/mg,购自igma公司）；Na2HPO4和NaH2PO4（化学纯,阿拉丁公司）；鸭蛋样品均采购自杭州超市和农贸市场。

2.2 样品制备

2.2.1 鸭蛋黄的制备将超市购得的熟咸鸭蛋的蛋黄与蛋白分离,将蛋黄放入均质机进行均质,制得鸭蛋黄样品。参照文献[28]中的传统咸鸭蛋腌制方法,选购同一批次新鲜鸭蛋,放入饱和食盐水中,储存于避光阴凉的室内,每隔5天取出10只腌制的鸭蛋,放入1 L水,水煮20 min,将蛋黄分离,放入均质机中进行均质。

2.2.2 酶解准确称取0.1 g（精确至0.0001g）蛋黄样品放入50 mL离心管,加入同位素内标d7-7α-羟基胆固醇200 ng,加入10 mL含5600 U/mL脂肪酶的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液 （pH=8.2）,涡旋10 min后放入37℃水浴振荡酶解8 h。

2.2.3 提取酶解液中加入5mL乙腈沉淀蛋白,加入20 mL正己烷-乙醚（80∶20,V/V）混合液提取,涡旋10min,9391 g离心5min,分取上清液后,取下层液重复提取1次,合并上清液,加入10mL超纯水,振荡水洗,转移有机相至50 mL蒸发瓶中,37℃条件下减压蒸干,加入5 mL正己烷复溶。

2.2.4 净化固相萃取柱法参考文献[29]的方法。选用规格为500mg的硅胶柱,首先用8mL乙酸乙酯活化,加入10mL正己烷平衡。将样品溶液上样,依次加入10mL正己烷-乙醚（95∶5,V/V）和25 mL正己烷/乙醚（90∶10,V/V）淋洗,最后加入8mL甲醇/丙酮（3∶1,V/V）进行洗脱,氮吹后用2 mL甲醇复溶,过0.22μm滤膜后,待进样。

2.3 仪器测定条件

2.3.1 色谱条件选择了Waters HSST3柱（100 mm×0.3μm）作为色谱柱分离COPs,柱温40℃,进样量5μL,以含0.1％甲酸的甲醇/乙腈（1∶1,V/V）混合液作为流动相B,含0.1％甲酸作为流动相A,流速为0.8 mL/min。洗脱梯度：0～16.5 min,70％B；16.5～17.0 min,70％ ～82％B；17.0～18.0 min,82％B；18.0～18.5 min,82％ ～87％B；18.5～21.0 min,87％B；21.0～21.5 min, 87％～95％B；21.5～23.0 min,95％B；23.0～23.1 min,95％～100％B；23.1～25.0min,100％B；25.0～25.1 mim,100％～70％B；25.1～28 min,70％B。

2.3.2 质谱条件大气压化学源（APCI）正离子模式,干燥气温度300℃,蒸发器温度450℃,干燥气流量6 L/min,雾化器压力3.45 Pa,毛细管电压4500 V,电晕电流4μA,其它质谱参数及离子对见表1。

表1 COPs及同位素内标的质谱分析参数Table 1 MS/MS parameters for cholesterol oxidation products（COPs）and d7-7α-OH

3 结果与讨论

3.1 色谱及质谱条件的优化

本研究共检测了11种COPs（见表2）,除7-酮基胆固醇外,其余COPs具有相同的分子质量,当其离子化后,均失去1个或2个水分子,生成的离子对相同,无法通过MRM多通道分别进行定量分析,因此需要通过液相色谱分离。本研究比较了不同流动相组成及其配比,最终选择以0.1％甲酸的甲醇-乙腈（1∶1,V/V）混合液作为有机相,含0.1％甲酸作为水相,进行梯度洗脱,均达到了基线分离（见图1）。

对于10种分子质量相同的COPs,不同离子对的灵敏度不同,20α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇、19R-羟基胆固醇、22R-羟基胆固醇和22S-羟基胆固醇的离子对367.3＞81.0响应最高且基质干扰较小,而胆甾烷-3,5,6-三醇,7α-羟基胆固醇、7β-羟基胆固醇、胆固醇5α,6α-环氧化物、胆固醇5β,6β-环氧化物和7-酮基胆固醇的离子对385.3＞367.2的响应最高,以此为定量离子对。

图1 11种COPs和d7-7α-OH的MRM图Fig.1 MRM chromatograms of mixed standard of 11 COPs and d7-7α-OH

3.2 酶解前处理方法的优化

3.2.2 沉淀剂和提取试剂的选择用乙腈与乙醇作为沉淀剂分别进行沉淀剂加入体积的优化,当加入乙腈的量与缓冲液的比例为1∶2的时候,沉淀效果最好,提取效率最高。同时优化了提取试剂的组成与配比,当提取溶剂为正己烷时,提取的样品溶液最为干净,基质效应最小,但胆甾烷-3,5,6-三醇（Tri-OH）的回收率低于40％,当逐渐增大提取溶剂中的乙醚比例时,Tri-OH的回收率也随之增高,最终选择正己烷/乙醚混合液（80∶20,V/V）作为提取试剂。

图2 酶解时间的优化Fig.2 Optimization ofenzymolysis time

3.3 酶解法方法学验证

3.3.1 标准曲线线性与定量限根据样品中COPs含量分别建立20,50,100,200,400,800, 1200 ng/mL和0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.5μg/mL系列标准曲线,以3.1节中的色-质谱法检测,结果显示,11种COPs在20～1200 ng/mL和200～3500 ng/mL范围内线性关系良好,且相关系数均≥0.996。根据样品基质中10倍信噪比的信号浓度作为定量限,得到不同的COPs的定量限,见表2。

表2 标准曲线线性与定量限Table 2 Linear range and LOQ

3.3.2 加标回收率和日内日间精密度针对蛋黄中COPs的含量,分别以低中高3个浓度水平进行加标回收实验,每个浓度水平每天平行取样测定6份,共测定4天,加标回收率在79.32％～104.12％之间,日内RSD在1.1％～13.8％之间,日间RSD在2.0％～12.9％之间,见表3。

表3 COPs回收率和精密度Table 3 Recovery and RSD of COPs

续表3（Continued to Table 3）

3.4 3种前处理方法的比较

将本法与皂化法和提取法测得值进行对比,皂化法和提取法分别参照文献[22,26]进行,以酶解法所测得样品中COPs含量为基准,就样品中含有的7种COPs的测定结果进行作图比较,由图3可见,在皂化法中除了Tri-OH和7-Keto以外的5种COPs的测量值与酶解法接近,范围在94.05％～107.49％之间。Tri-OH所测值偏低的原因主要是因为皂化法使用正己烷提取,而Tri-OH极性较大,正己烷对Tri-OH的提取率不高；7-Keto所测值偏低是因为在碱性条件下容易被破坏降解成其它物质,导致测定结果偏低。直接提取法与酶解法相比,主要区别在于5β,6β-Expo和5α,6α-Expo化合物检测值偏低,这是因为直接提取法未完全提取出脂质中结合的COPs,而在酶解法中由于脂肪得到酶解,使胆固醇环氧化物可以释放出来,酶解法测定值高于提取法。因此,通过比较3种方法可以得出,相比于皂化法和提取法,酶解法具有更高的提取效率,是一种较为理想的前处理方法。

图3 3种前处理方法的比较Fig.3 Comparison of three pretreatmentmethods

3.5 方法应用

3.5.1 咸鸭蛋腌制过程中的COPs含量变化检测分别检测不同腌制时间的咸鸭蛋中COPs含量,结果表明,随着腌制时间的增加,咸鸭蛋黄中的环氧化物的含量先增加后降低,在15～20天之间的COPs总含量达到最高。COPs的总量变化趋势与环氧化物的含量变化基本一致。其它几种COPs含量在腌制过程中基本不变,检测的结果见表4。

“不好说。”老福摁灭了烟头和善地说：“所以我们要搞清楚事情的真相，给你们包括你死去的姑妈一个满意的答复。”

3.5.2 市售咸鸭蛋的检测选取市场上销售的11种咸鸭蛋,按2.2制样后使用本方法进行检测,咸鸭蛋黄中检出了7α-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、胆固醇5α,6α-环氧化物、胆固醇5β,6β-环氧化物和胆甾烷-3,5,6-三醇等7种COPs,未检出22R-羟基胆固醇、20α-羟基胆固醇、25-羟基胆固醇和22S-羟基胆固醇,同时发现咸鸭蛋中的COPs总量相差较大,最高值达到85.876μg/g,是最低值的2.5倍。这可能与腌制工艺以及储存方式有关,值得进一步研究。

表4 腌制过程中咸鸭蛋COPs含量变化Table 4 Variation of COPs content in salted eggs in the process of sousing（n=3）

4 结论

将酶解法结合固相萃取作为前处理,建立了UPLC-APCI-MS/MS准确测定咸鸭蛋黄中11种COPs的方法。对比了酶解法、皂化法和提取法,验证了酶解法的提取完全性和准确性。利用本方法比较了传统腌制咸鸭蛋过程鸭蛋黄中的COPs变化,对11份市售的咸鸭蛋中COPs含量进行测定,检出7种COPs,并发现在不同的样品中含量差别明显,为进一步研究腌制工艺及储存方式对咸鸭蛋黄中的COPs含量变化提供了一种可靠的分析方法。

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（Received 23 June 2015；accepted 6 September 2015）

This work was supported by the Research Project for Application of the Public welfare Technology,Zhejiang Province（No.2015C37061）

Simultaneous Determ ination of 11 Cholesterol Oxidation Products in Salted Duck Egg Yolk by Enzymolysis-Liquid Chromatography Tandem M ass Spectrometry

KE Xing1,HUANG Bai-Fen*2,LÜMei-Ling3,MOWei-Min*1,REN Yi-Ping21（College ofChemical Engineering；Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China）
2（Zhejiang Center for Disease Control and Prevention,Hangzhou 310051,China）
3（Agilent technologies Co.,LTD in China,Beijing 100102,China）

A method for simultaneous quantification of 11 cholesterol oxidation products（COPs）in yolk of salted duck egg was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）with enzymatic treatment.Firstly,the yolk of salted duck egg was digested by lipase at 37℃,and COPswere extracted by n-hexane and diethyl ethermixture（8∶2,V/V）.The supernatant was enriched and purified by solid phase extraction of silica.Eleven COPswere separated by UPLCHSST3 column（100mm× 2.1 mm,0.3μm）with water and methanol/acetonitrile（1∶1,V/V）both containing 0.1％formic acid.All COPswere simultaneously determined by UPLC-MS/MSwithmultiple reactionmonitoringmode（MRM）.The d7-7α-OH cholesterol was used as internal standard.The results showed that the linear ranges were 20-1200 ng/mL and 200-3500 ng/mL with correlation coefficient（r≥0.996）.The recoveries of three spiking levelswere between 79.3％and 104.1％,and relative standard deviations（RSD）were 2.0％and 12.9％.The limit of quantification（LOQ）was 0.08-0.40μg/g.The established method with good repeatability and robust recovery can be applied to quantify the levels of11 COPs in yolk of salted duck eggs.

Cholesterol oxidation products；Salted duck egg yolk；Enzymaticmethod；Liquid chromatography tandem mass spectrometry

10.11895/j.issn.0253-3820.150514

2015-06-23收稿；2015-09-06接受

本文系浙江省公益性技术应用研究计划（No.2015C37061）资助