高浓度抗坏血酸存在下氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰电极对尿酸的选择性测定

李宁波 何凤云李丽 胡耀娟 白程超 段雨晴（南京晓庄学院,环境科学学院,南京211171）

高浓度抗坏血酸存在下氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰电极对尿酸的选择性测定

李宁波 何凤云*李丽 胡耀娟 白程超 段雨晴
（南京晓庄学院,环境科学学院,南京211171）

采用一步水热合成法制备了氮掺杂石墨烯,采用滴涂法制备了氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰电极（N-GN-CS/GCE）,研究了在大量抗坏血酸存在下尿酸在此修饰电极上的伏安行为。结果表明,尿酸在此修饰电极上有一个明显的氧化峰,其峰电流约为裸电极的7倍；同时,氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合修饰材料显著提高了尿酸对抗坏血酸的选择性,尿酸和抗坏血酸的峰电位差可达362 mV,可实现高浓度抗坏血酸存在下尿酸的选择性测定。优化了修饰材料的滴涂量、溶液pH值、扫描速度等实验参数,利用差分脉冲伏安法对尿酸进行测定,尿酸的脉冲峰电流与尿酸浓度分别在0.1～20μmol/L和20～400μmol/L浓度范围呈良好的线性关系,检出限为0.01μmol/L,相对标准偏差为3.3％（n=8）。将本方法用于实际尿样的测定,回收率为99.7％～103.4％。

氮掺杂石墨烯；抗坏血酸；尿酸

1 引 言

尿酸（UA）是嘌呤的主要代谢产物,在人体体液中的含量变化可反映出人体内新陈代谢和免疫等机能的状况[1]。UA含量异常是痛风、肾功能衰竭和高尿酸血症莱-尼综合征的征兆[2]。因此,尿酸的检测和分析对临床诊断、了解病情进展具有重要意义。目前,尿酸的检测方法有荧光法[3]、高效液相色谱法[4]、酶方法[5]和电化学方法[2,6～10]等。与其它方法相比,电化学具有操作简便,成本低廉,灵敏度高,检出限低等优点。但是利用电化学方法测定UA的一个主要问题是体液中共存的抗坏血酸（AA）的干扰。因此,建立在大量抗坏血酸（AA）存在下准确测定UA的方法,更具有实际意义。

石墨烯是一种由单层碳原子紧密堆积成二维蜂窝状晶体结构的新型炭质材料,具有比表面积高、导电性能好、机械强度高、易于修饰/功能化及可大规模生产等优点,已成为当前的研究热点之一[11,12]。研究者发现纯石墨烯的活性位点不够,不具有选择性,在实际应用中不具备很好的匹配度等问题。对石墨烯进行掺杂是一种弥补石墨烯的缺陷有效的方法,其中氮掺杂的研究最多[13],氮原子能诱导更多的正电荷到相邻的碳原子上,有效提高阴离子交换性能和电催化活性,并且具有更优异的稳定性。

本研究以尿素作为氮源和还原剂[14,15],采用一步水热法合成氮掺杂石墨烯,合成的氮掺杂石墨烯能均匀分散在壳聚糖溶液中,且性能稳定。用氮掺杂石墨烯/壳聚糖复合材料制备修饰电极,研究了尿酸在此电极上的电化学行为,优化了测定条件,探讨了尿酸在此电极上的氧化机理,采用电化学方法测定尿酸,并实现了大量抗坏血酸存在下尿酸的选择性检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）；S-4800场发射扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）；KQ2200型超声波清洗器（功率100W,昆山市超声仪器公司）；pH-3C型精密pH计（上海雷磁仪器厂）。2400Ⅱseries CHN元素分析仪（美国PE公司）。ZD-F12型冷冻干燥箱（南京载智自动化设备公司）。

尿素（分析纯,上海久亿化学试剂有限公司）；石墨粉（光谱纯）、抗坏血酸（分析纯,国药集团化学试剂有限公司）,其它试剂均为分析纯。实验用水均为二次去离子水。

2.2 氮掺杂石墨烯（N-GN）的制备

以石墨粉为原料,通过改进的文献[16]的方法制备氧化石墨烯（GO）。采用一步水热合成法[14,15], 取15 mg GO溶于30 mL水中,超声10 min,使GO均匀分散。依次加入3 mL 0.1 mol/L NaOH溶液, 0.45 g尿素,混合后超声数分钟。放入反应釜中,在160℃下反应12 h。用水洗涤至中性,离心3次,去除溶液,得到黑色沉淀,在-10℃冷冻干燥20 h,即得氮掺杂石墨烯（N-GN）。

2.3 修饰电极的制备

玻碳电极分别用0.3和0.05μm Al2O3粉末在麂皮上打磨成镜面,用二次去离子水小心洗涤后,再依次放入HNO3（1∶1,V/V）、乙醇、去离子水中各超声3 min,自然干燥备用。

取1 mg N-GN溶于1 mL 0.5％HAc壳聚糖溶液（CS）,超声至均匀分散,形成1mg/mL N-GN复合物分散液。取8μL分散液,滴涂在玻碳电极表面,缓慢滴加使其均匀分散,在室温下自然晾干,制得氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰玻碳电极（N-GN-CS/GCE）。

2.4 实验方法

取适量尿酸（UA）标准溶液或样品待测液于电解池中,采用三电极体系,以GCE或修饰电极为工作电极,铂片电极为辅助电极,饱和甘汞电极（SCE）为参比电极。采用CV或DPV进行扫描,记录-0.2～0.8 V的峰电流和峰电位,每次扫描结束后,用二次水冲洗电极,并用吸水纸吸干后,即可进行下一次测定。

3 结果与讨论

3.1 氮掺杂石墨烯的表征

图1为氮掺杂石墨烯（a）及氮掺杂石墨烯/壳聚糖（b）复合物的扫描电镜图。从图1可见,氮掺杂石墨烯提供了大的比表面积,而壳聚糖的加入,可以使氮掺杂石墨烯在电极上更好地成膜,提高修饰电极的稳定性。

利用元素分析仪（CHN）对氧化石墨烯和冷冻干燥后的氮掺杂石墨烯进行碳氮含量测定,结果表明,氧化石墨烯中的碳含量为42.40％,氮含量为0；氮掺杂石墨烯中碳含量为68.88％,氮含量为5.61％,与苏鹏等[14]报道的以尿素为氮源（GO与尿素比例为1∶30）得到的氮掺杂石墨烯中氮的含量相当,说明通过水热法可以制备氮掺杂石墨烯。

图1 氮掺杂石墨烯（a）和氮掺杂石墨烯/壳聚糖（b）复合物的扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrographs of nitrogen-doped graphene（N-GN）（a）and nitrogen-doped graphene/chitosan（N-GN-CS）composite（b）

3.2 UA与AA在不同电极上的电化学响应

将不同电极放入仅含有0.2mmol/L UA和10mmol/L AA-0.2mmol/L UA的PBS缓冲溶液（pH 5.5）中,以0.1 V/s循环伏安扫描,得到的循环伏安图。从图2A可见,UA在4种电极上均只出现氧化峰,说明 UA在电极上为完全不可逆氧化过程。UA在 GCE（曲线 a）上有一个小氧化峰（Epa=0.376 V,Ipa=3.142μA）；GO/GCE（曲线 b）的氧化峰电流略有增加（Epa=0.404 V, Ipa=4.361μA）；在GN/CS/GCE（曲线 c）的氧化峰电流增大,约为裸电极的3倍（Epa=0.402 V, Ipa=9.4μA）,电位较裸电极正移26 mV,峰形有所改善；UA在N-GN-CS/GCE（曲线d）的氧化峰电流增大,约为裸电极上的7倍（Epa=0.380 V,Ipa=21.97μA）,峰电流明显增大。这是由于氮掺杂石墨烯大的比表面积和较多的反应活性点,使其对UA具有良好的电催化作用,同时良好的导电能力加快了电子传递速度,也提高检测的灵敏度；此外,该复合膜具有高的选择性和强的抗干扰能力,使其在大量抗坏血酸存在下,能与UA很好地分离,实现UA的准确测定。图2B显示了在10mmol/L AA存在下,0.2mmol/L UA在不同电极上的电化学行为。从图2B可见,UA和AA在GCE（曲线a）和GO/GCE（曲线b）上无法实现分离,仅出现一个宽峰；在GN-CS/GCE（曲线c）出现了两个峰,但峰型差,电流信号弱；在N-GN-CS/GCE上,UA和AA可以实现良好分离,两者峰电位差可达362 mV,说明氮掺杂石墨烯在尿酸的电化学检测中比石墨烯更具有优势,将此修饰电极用于尿液中尿酸的测定,可不受尿液中大量AA的干扰。

3.3 pH值对UA电化学响应的影响

图2 （A）尿酸（0.2mmol/L）在GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）和N-GN-CS/GCE（d）上的循环伏安图（A）；（B）大量抗坏血酸（10mmol/L）存在下尿酸（0.2mmol/L）在GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）和N-GN-CS/GCE（d）上的循环伏安图（B）Fig.2 Cyclic voltammograms of uric acid（0.2mmol/L）at bare GCE（a）,GO/GCE（b）,GN-CS/GCE（c）and N-GN-CS/GCE（d）in the absence（A）and presence（B）of ascorbic acid（10mmol/L）缓冲溶液（Buffer）：0.1 mol/L PBS（pH 5.5）；扫速（scan rate）：0.1 V/s。

图3给出了不同pH条件下UA在N-GN-CS/GCE上的循环伏安图。随着pH值增大,UA的氧化峰电位逐渐负移,说明电极反应过程有质子参与。经过拟合,UA氧化峰电位与pH值呈良好的线性关系,线性方程为 Epa（V）=-0.0522pH+ 0.6692（R2=0.9913）,方程斜率为-52.2 mV/pH,接近理论斜率-59 mV/pH,说明UA在N-GN/GCE上反应过程中转移的质子与电子数比为1。pH值对氧化峰电流也有影响；pH=5.5时,氧化峰电流达到最大值。因此,选择pH=5.5的PBS缓冲溶液作为支持电解质。

图3 0.2mmol/L尿酸在不同pH的磷酸盐缓冲溶液中在N-GN-CS/GCE上的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammograms of 0.2mmol/L uric acid at N-GN-CS/GCE in PBS solution with different pH valuesa-g：pH 5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0,9.0；scan rate：0.1 V/s.

3.4 扫描速度的影响

考察了扫速对UA伏安行为的影响,结果表明,在0.01～0.2 V/s范围内,随着扫速增大,UA的氧化峰电流不断增大,且氧化峰电流（Ipa）与扫描速度（v）呈良好的线性关系,线性方程为：Ipa（μA）= 55.464v+2.974（R2=0.9910）,这说明UA在N-GN-CS/GCE电极上的氧化为吸附控制。且随着扫描速度的增大,电位逐渐正移,是不可逆反应。

3.5 UA在N-GN-CS/GCE上的氧化过程

对于吸附控制的不可逆的电极反应过程,根据Laviron公式[17]公式：

式中,α表示电子转移系数,kθ为标准速率常数,n为电子转移数,v为扫描速度,Eθ为标准电位。通常对于不可逆电极过程α=0.5,经过计算（Ep=0.056log v+0.4555,R2=0.9862）,n=1.9,所以该反应是一个2电子2质子的电化学过程。

3.6 线性范围和检出限

在pH=5.5的PBS缓冲溶液中,不同浓度的UA差分脉冲伏安（DPV）图如图4所示。在0.1～20μmol/L和20～400μmol/L范围内,UA的氧化峰电流与浓度呈良好的线性关系,线性方程分别为：Ip（μA）=0.347C（μmol/L）+0.3573（R2=0.9957）和Ip（μA）=0.09721C（μmol/L） +6.0760 （R2= 0.9942）,检出限（S/N=3）为0.01μmol/L。与已报道的对UA的电化学方法[2,6～10,19～23]相比,本方法线性范围宽,检出限较低,能满足对实际样品的测定。

3.7 重现性、稳定性和干扰实验

图4 不同浓度的UA在N-GN-CS/GCE上的差分脉冲伏安图Fig.4 Differential pulse voltammograms of different concentrations of uric acid at N-GN-CS/GCE曲线 a～k：0.1,0.2,0.4,2,4,8,20,40,80,200和400μmol/L。缓冲溶液：0.1 mol/L PBS（pH=5.5）；扫速：0.1 V/s；电位增量0.004 V,振幅0.05 V,脉冲宽度0.05 s,脉冲周期0.2 s,沉积电位为-0.4 V,沉积时间是40 s。Buffer：0.1 mol/LPBS（pH=5.5）；Scan rate：0.1 V/s；Potential increase：0.004 V；Amplitude：0.05 V；Pulse width：0.05 s；Pulse period：0.2 s；Deposition potential：-0.4 V；Deposition time：40 s.

采用差分脉冲法连续测定0.1mmol/L UA标准溶液8次,峰电流的相对标准偏差（RSD）为3.3％。在相同的实验条件下制备5支修饰电极,平行测定0.1mmol/L UA标准溶液,RSD为4.5％。将修饰电极避光浸入空白底液,4℃保存5 d后再次进行测定,峰电流下降为原来的96.7％。

在含0.1mmol/L UA的PBS溶液（pH 5.5）中测定了一些可能共存的无机离子和有机物对UA的干扰。结果表明,在允许测量误差不超过5％的情况下,100倍的Ca2+、Cl-、Na+、K+、Ba2+和,50倍的尿素、酪氨酸、L-赖氨酸,10倍的葡萄糖、肾上腺素、多巴胺、蔗糖和柠檬酸盐均不干扰测定。本方法对UA的测定具有良好的选择性,可用于尿样中UA含量的测定。

3.8 尿样测定及回收率实验

将制备的传感器用于尿样中UA的测定,每次取2.50 mL尿样于含有1mmol/L AA的0.10 mol/L PBS溶液中,定容至50 mL。用DPV进行测定。加入已知样的标准品进行回收率测定,测定结果见表1。

表1 尿样中尿酸的测定（n=3）Table 1 Determination of uric acid in urine samples（n=3）

4 结论

制备的氮掺杂石墨烯/壳聚糖修饰电极（N-GN-CS/GCE）能够促进UA在此电极上的电子转移,并能有效消除尿液中共存的AA的干扰。据此建立的测定UA的电化学方法具有线性范围宽、检出限低等优点,为实际尿液中UA的准确、灵敏监测提供了新方法。

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（Received 27 April 2015；accepted 10 August2015）

Thiswork was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.11254004,31460035）

Selective Determ ination of Uric Acid at Nitrogen-doped Graphene/Chitosan Com posite M odified Electrode in the Presence of a Large Amount of Ascorbic Acid

LINing-Bo,HE Feng-Yun*,LILi,HU Yao-Juan,BAICheng-Chao,DUAN Yu-Qing
（School of Environmental Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China）

Nitrogen-doped graphene was synthesized by one-step hydrothermal method.A nitrogen-doped graphene-chitosan modified electrode（N-GN-CS/GCE）was prepared and the electrochemical behavior of uric acid in the presence of a large amount of ascorbic acid was investigated at themodified electrode.The peak current of uric acid at themodified electrode was7 times as that at unmodified electrode.The peak separation of uric acid and ascorbic acid was 362 mV and uric acid could be accurately determined in the presence of a large amount of ascorbic acid.Some experimental parameters such as dopping volume,pH and scan rate were optimized and a standard curve was also established using differential pulse voltammetry.The linear range between the peak current and the concentration of uric acid was 0.1～20μmol/L and 20-400μmol/L,and the detection limitwas estimated to be 0.01μmol/L.The proposedmethod was applied to the analysis of uric acid in human urine sample with recoveries between 99.7％and 103.4％.

Nitrogen dopped graphene；Ascorbic acid；Uric acid

10.11895/j.issn.0253-3820.150340

2015-04-27收稿；2015-08-10接受

本文系南京大学生命分析国家重点实验室开放研究基金（No.SKLACLS1308）、江苏省大学生创新训练项目（No.201411460025Y）、南京晓庄学院化学一级重点学科项目资助

E-mail：hefengyun1976@163.com