有机白萝卜 表皮附生乳酸菌抗生素耐药性分析

林 凯，蔡 婷，徐顾榕，宋菲菲，袁春红，陈 功，向文良,*，张 庆

有机白萝卜 表皮附生乳酸菌抗生素耐药性分析

林 凯1，蔡 婷1，徐顾榕1，宋菲菲1，袁春红1，陈 功2，向文良1,*，张 庆1

（1.西华大学生物工程学院，西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所，四川省食品生物技术重点实验室，
四川 成都 610039；2.四川省食品发酵工业研究设计院，四川 成都 611130）

以市售有机白萝卜为研究对象，分析其表皮附生乳酸菌对四环素（tetracycline，TET）、链霉素（streptomycin，STR）和青霉素G（penicillin G，PEN）的耐药性。分离菌株的生理生化特征、随机扩增多态性DNA聚类（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、16S rRNA、耐药性和耐药表型多态分析表明：有机白萝卜表皮附生有约4.67×103CFU/cm2的乳酸菌。分离的187株乳酸菌分别属于Pediococcus pentosaceus（114/187）、Weissella cibaria（9/187）、Leuconostoc mesenteroides（18/187）、Leuconostoc pseudomesenteroides（7/187）、Leuconostoc citreum（20/187）和Leuconostoc holzapfelii（19/187）。其中，25株（13.37%）对TET、STR和PEN表现出单一或多重耐药性。在P. pentosaceus中，分别有2株对STR、TET和PEN三重耐药，13株对STR和TET二重耐药和4株对TET单一耐药；L. citreum中，分别有1株对STR、TET和PEN三重耐药和1株对STR单一耐药；L. mesenteroides中，分别有1株对TET单一耐药和1株对TET和PEN二重耐药；L. pseudomesenteroides和W. cibaria中，分别有1株对STR和TET、STR和PEN二重耐药。

有机白萝卜；乳酸菌；四环素；链霉素；青霉素G；耐药性

随着生活水平逐步提高，人们越来越重视食品安全问题。有机蔬菜纯天然、不含任何农药残留，通常被称为“零污染”蔬菜，因此备受消费者青睐[1]。然而，近年来，随着抗生素耐药性对环境面源污染的加剧，曾经被认为“零污染”的有机蔬菜中也发现了抗生素耐药性，为有机蔬菜的食品安全性带来了新的挑战[2]。抗生素耐药性作为一种新型的污染类型由美国学者Pruden[3]于2006年首先提出，由于抗生素在环境介质中的持久性残留以及在不同宿主间的传播往往比抗生素本身危害更大，因此其对公共健康和食品安全构成的威胁使其目前已成为植物学、土壤学、环境科学和食品科学等领域的研究热点[4-6]。

抗生素在畜牧业和养殖业的大量使用或滥用造成抗生素残留对动物肠道微生物的耐药性选择和诱导是环境抗生素耐药性面源污染的重要来源，也是有机食物蔬菜通过动物粪便等有机肥污染抗生素耐药性的重要原因[4-5,7]。研究发现，从20世纪30年代抗生素被发现开始，随着抗生素使用量逐渐增加，土壤微生物对常用抗生素的耐药性明显增加[5]。施用奶牛场有机肥的土壤中有70%的抗生素抗性基因被诱导[8-9]，对家畜粪便、河流、灌溉渠、土壤和空气中的微生物宏基因组研究，发现了16种四环素抗性基因、3种磺胺类抗性基因、10种β-内酰胺类抗性基因[5,10-12]。有机蔬菜种植过程中，携带有这些耐药基因的菌株不可避免地会附着在蔬菜表面，为有机蔬菜特别是鲜食有机蔬菜的食品安全带来潜在风险。

白萝卜（Raphanus sativusL.）是一种常见的 根茎类蔬菜，属十字花科、萝卜属的一年或二年生草本双子叶植物[13]。我国白萝卜栽培历史悠久，是一种药食同源的大众化蔬菜，富含VC、芥子油、淀粉酶和粗纤维，具有促进消化、增强食欲、加快胃肠蠕动和止咳化痰的作用，可以治疗或辅助治疗多种疾病，为食疗佳品，被本草纲目称为“蔬中最有利者”，因此常被作为水果而鲜食[13]。乳酸菌是蔬菜表面常见的附生微生物，长期以来被普遍认为是安全[14]。然而，近年来发现越来越多抗生素耐药乳酸菌具有一定可转移耐药性，为乳酸菌的安全敲响了警钟。那么，通过有机种植的白萝卜表皮是否附生着抗生素耐药性乳酸菌呢？国内外目前鲜有对此方面的报道。因此，本研究以成都平原有机种植的白萝卜为研究材料，分析其表皮附生的四环素（tetracycline，TET）、链霉素（streptomycin，STR）和青霉素G（penicillin G，PEN）耐药性乳酸菌，并评估其耐药性，以期为有机白萝卜鲜食的食品安全评价提供参考。

1 材料与方法

1.1材料与培养基

有机白萝卜样品，购于成都某有机蔬菜种植基地零售超市。

培养基：MRS培养基和改良MRS琼脂培养基（含0.75%的CaCO3）均按文献[15]方法配制。

1.2方法

1.2.1菌株的分离与生化特征分析

随机选取有机白萝卜表皮10 g（外表面积约40 cm2），加入到装有90 mL无菌生理盐水的无菌均质袋中，用Bagmixer拍击式均质器均质2 min。取适量均质液用无菌生理盐水10倍梯度稀释后涂布于改良MRS琼脂培养基上，37℃倒置培养48 h。选取菌落适宜的平板，挑取有明显溶钙圈的菌落于MRS琼脂培养基上划线纯化2次，纯化后的菌株接种到MRS液体培养基中富集培养后，转移至30%的无菌甘油冻藏管中，-20℃保存备用。菌株的生理生化特征按《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》[15]中的鉴定方法进行。

1.2.2随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）聚类分析

分离菌株的基因组D N A提取和R A P D聚类分析参见Xiang Wenliang等[16]的方法。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增采用引物G1：5’-GAAGTCGTAACAAGG-3’和L1：5’-CAAGGCATCCACCGT-3’。PCR扩增条件：94℃变性1 min，55℃退火2 min，72℃延伸3 min，25个循环。PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）后条带经LabImage 2.7.1识别并转化成0/1矩阵，采用NTSYS PC 2.11做非加权组平均法（unweighited pair group method with arithmetic mean，UPGMA）聚类分析[17-18]。

1.2.3 16S rRNA序列分析

分离菌株的16S rRNA扩增及序列分析参见Xiang Wenliang等[19]的方法。采用细菌16S rRNA通用引物Eu27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和原核微生物特异性引物1490R：5’-GGTTACCTTG TTACGACTT-3’。PCR条件：95℃预变性5 min，然后95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，最后72℃保持10 min。PCR产物连接到pGEM-T载体后克隆入感受态细胞E. coliDH5α中，筛选阳性克隆子，提取重组质粒对16S rRNA测序，无嵌合体的序列用CLASSIFIER（RDPII，http://rdp.cme.msu.edu./ classifier/classifier.jsp）软件与RDP数据库中的模式菌株进行相似性比较，确定菌株的分类地位。

1.2.4抗生素耐药性分析

依据欧洲抗微生物药物敏感委员会（http://www. eucast.org）关于微生物对不同抗生素敏感阈值X的数据库（http://www.eucast.org/mic_distributions/），分析菌株的抗生素耐药性。当分离菌株的最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤X时为敏感性菌株，反之当MIC＞X时为耐药性菌株。

MIC测定采用微量肉汤稀释法[20]。分别将TET、STR和PEN配制成2 048μg/mL的贮存液，MRS液体培养基2倍梯度稀释成使用液。STR的梯度稀释质量浓度为2～1 024μg/mL，TET和PEN的梯度稀释质量浓度为1～512μg/mL。向96孔板中加入198μL含不同浓度抗生素的MRS液体培养基后，接种2μL分离菌株的培养液（1×107CFU/mL），37℃静止培养24 h后，统计不同菌株的MIC，每组实验重复3次并设置空白对照。

1.2.5耐药表型的多态性分析

以耐药菌株对TET、STR和PEN的抗生素敏感最高阈值X为起始点，不同菌株的MIC为终止质量浓度，设置不同的质量浓度梯度，统计分离株在各质量浓度下的生长情况，将各种质量浓度下“耐药”赋值为“1”、“敏感”赋值为“0”，构建分离菌株抗生素耐药表型的“0”和“1”的矩阵。利用NTSYS PC 2.11软件做UPGMA聚类分析[17-18]，并以各分离株的MIC构建点阵图，分析有机白萝卜表皮附生乳酸菌对抗生素的耐药表型多态性。

2 结果与分析

2.1菌株的分离及生化特征

表1 有机白萝卜表皮附生乳酸菌的生理生化特征TTaabbllee 11 PPhhyyssiioolloogical and biochemical characteristics of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

乳酸菌是指发酵时能够产生乳酸的一大类细菌，包括40个属，近300个种。MRS平板分离乳酸菌时，利用其产生的乳酸溶解CaCO3形成溶钙圈的特性，实现乳酸菌的初步分离。在当前研究中，10 g萝卜表皮样品（外表面积约40 cm2）在稀释度为10-3、接种100μL时，平板上出现了187个溶钙圈菌落，表明有机白萝卜表面附生乳酸菌的量约4.67×103CFU/cm2。依据能否利用糖和醇的特征，这些菌株被分成6个簇群（表1），其中，菌株LCB005代表的簇群最大，约占有机白萝卜表皮附生乳酸菌的61%；菌株LCB035代表的簇群最小，仅占3.7%。

2.2 RAPD多态性聚类分析

利用RAPD技术对187株有机白萝卜表皮附生乳酸菌进行聚类分析发现：引物G1和L1的PCR随机扩增图谱表现出了明显的多态性，其条带通过NTSYS软件的UPGMA法聚类后分为6个簇群（图1）。其中，有114株与LCB005的图谱一致，与LCB020、LCB035、LCB066、LCB147和LCB178的图谱一致的菌株分别有18、7、20、19、9株。RAPD聚类表现出了与表1一致的分类关系，揭示了有机白萝卜表皮附生的乳酸菌有6个簇群。

图1 有机白萝卜表皮附生乳酸菌的RAPD分型及聚类分析Fig.1 RAPD typing and cluster analysis of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

2.3 16S rRNA分析

Stackebrandt等[21]认为：当细菌16S rRNA序列同源性≥97%时可以认为是一个属，序列同源性≥98%时则可以认为是一个种。为进一步确定有机白萝卜表皮附生乳酸菌的分类学地位，上述6个簇群中，＜10株的簇群随机选取5株，10～20株的簇群随机选取10株，＞100株的簇群随机选取30株进行16S rRNA序列分析。结果表明：有机白萝卜表皮的附生乳酸菌主要属于Weissella、Leuconostoc和Pediococcus属（表2）。其中，LCB005代表的114株分离株属于Pediococcus属，随机选取的30株菌的16S rRNA序列与P. pentosaceusDSM 20336T的16S rRNA序列相似性皆为99%（表2），这些菌株对糖或醇的利用与DSM 20336T一致（表2），因此LCB005群被鉴定为P. pentosaceus，占61.0%。LCB178代表的9株菌属于Weissella属，随机选取的5株菌的16S rRNA序列与W. cibariaLMG 17699T的16S rRNA序列相似性为100%（表2）。在糖或醇的利用方面，LCB178群与LMG 17699T一致（表2），因此被鉴定为W. cibaria，占所有附生乳酸菌的4.8%。其他64株乳酸菌均属于Leuconostoc属，LCB020、LCB035、LCB066和LCB147群中所分析菌株的16S rRNA序列分别与L. mesenteroidesATCC 8293T、L. pseudomesenteroidesNRIC 1777T、L. citreumATCC 49370T和L. holzapfeliiLMG 23990T的16S rRNA序列相似性为99%（表2），对糖或醇的利用也分别与各自簇群的相似菌株相同。因此，LCB020、LCB035、LCB066和LCB147群分别鉴定为L. mesenteroides（9.6%）、L. pseudomesenteroides（3.7%）、L. citreum（10.7%）和L. holzapfelii（10.2%）。

表2 有机白萝卜表皮附生乳酸菌的分类地位与群落构成Table 2 Community structure and classification of epibiotic lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

2.4 抗生素耐药性分析

表3 有机白萝卜表皮附生的部分乳酸菌对TET、STR和PEN的MIC与耐药性Table 3 TET,STR and PEN antibiotic resistance and MICs for eppibiotic lactc acid bacteria on the surface of organic white radish

在187株萝卜表皮附生乳酸菌中，除L. holzapfelii种的分离株未发现耐药菌株外，其他5个种中共计有25株菌的MIC＞欧洲抗微生物药物敏感委员会规定的阈值X（表3），约占分离菌株的13.37%。在114株P. pentosaceus菌株中，有19株（10.16%）表现出了抗生素耐药，其中有4株（2.14%）表现出对TET的单一耐药，13株（8.02%）表现出对TET和STR的二重耐药，有2株（1.07%）同时表现出了对TET、STR和PEN的三重耐药（表3）；此外，9株L. citreum中，也有1株（0.53%）同时表现出对TET、STR和PEN的三重耐药（表3）。在18株L. mesenteroides中，分别有1株（0.53%）表现出对TET的单一耐药、1株（0.53%）表现出对TET和PEN的二重耐药（表3）。在7株L. pseudomesenteroides和9株W. cibaria中，分别有1株（0.53%）表现出对STR和TET、STR和PEN的二重耐药。总体而言，分离菌株对抑制细胞壁合成的PEN比抑制蛋白合成的STR和TET更敏感，且部分菌株表现出多重耐药。

2.5耐药性表型的多态性分析

图2 有机白萝卜表皮附生乳酸菌对TET、STR和PEENN的耐药表型多态性分析Fig.2 Phenotype polymorphism of TET, STR and PEN antibiotic resistance of lactic acid bacteria on the surface of organic white radish

NTSYS聚类发现：有机萝卜表皮附生的TET、STR和PEN耐药性乳酸菌对同一种抗生素具有不同的MIC；多数耐药性乳酸菌表现出了多重耐药，只有少数菌株仅对1种抗生素具有耐药性（图2）。所有分离的耐药性乳酸菌中，P. pentosaceusLCB122、P. pentosaceusLCB126和L. citreumLCB068对3种抗生素表现出多重耐药（图2）；L. citreumLCB066和P. pentosaceusLCB018、P. pentosaceusLCB030、P. pentosaceusLCB085、P. pentosaceusLCB105、L. mesenteroidesLCB165分别对STR和TET表现单一耐药（图2）；在二重耐药性菌株中，除W. cibariaLCB178和L. mesenteroidesLCB141分别对STR和PEN、TET和PEN表现出二重耐药外，其他二重耐药菌株均表现出对STR和TET的二重耐药。所有耐药菌株的MIC均高出相应抗生素敏感阈值X多倍，表现出了较强的耐药性，其中P. pentosaceusLCB122的耐药性最强，其对TET、STR和PEN的MIC分别达到512μg/mL（阈值X=8μg/mL）、＞1 024μg/mL（X=64μg/mL）和512μg/mL（X=4μg/mL）。

3 结 论

有机蔬菜的种植和产品认定有着严格的质量标准，因此被认为是最安全的蔬菜。然而，这些标准通常只关注与蔬菜质量和有机特性相关的一些指标，如：种植过程、产品风味、营养和健康等，很少注重有机蔬菜的微生物，特别是抗生素耐药性指标[2]。当前对有机白萝卜表皮附生乳酸菌的研究表明：有机白萝卜表面附生乳酸菌的量约为4.67×103CFU/cm2，这些菌主要属于P. pentosaceus（61.0%）、W. cibaria（4.8%）、L. mesenteroides（9.6%）、L. pseudomesenteroides（3.7%）、L. citreum（10.7%）和L. holzapfelii（10.2%）。随着抗生素耐药性对环境面源污染的加剧，有机白萝卜表皮附生的乳酸菌中也出现了耐药性。在187株乳酸菌分离株中，除L. holzapfelii未发现耐药性外，其他种中均出现了TET、STR和PEN的耐药菌株（13.37%）。其中，多数TET、STR和PEN的耐药乳酸菌表现出多重耐药，只有少数单一耐药。在P. pentosaceus中，分别有2株对STR、TET和PEN表现出三重耐药、13株对STR和TET表现出二重耐药和4株对TET表现出单一耐药；L. citreum中，分别有1株对STR、TET和PEN三重耐药和1株对STR单一耐药；L. mesenteroides中，分别有1株对TET单一耐药和1株对TET和PEN二重耐药；W. cibaria中有1株对STR和PEN二重耐药；L. pseudomesenteroides中有1株对STR和TET二重耐药。这些耐药菌株对同一种抗生素具有不同的MIC，所有耐药菌株的MIC均高出相应抗生素敏感阈值X多倍，表现出了较强的耐药性，其中P. pentosaceusLCB122的耐药性最强，其对TET、STR和PEN的MIC分别达到512、＞1 024、512μg/mL。有机白萝卜表皮发现的抗生素耐药性为鲜食有机白萝卜的食品安全埋下了隐患。因此，需建立有机白萝卜表皮附生抗生素耐药乳酸菌的检测与防控体系，确保有机白萝卜的食品安全，维护广大消费者的健康权益。

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Antibiotic Resistance of Epibiotic Lactic Acid Bacteria on the Surface of Organic White Radish

LIN Kai1, CAI Ting1, XU Gurong1, SONG Feifei1, YUAN Chunhong1, CHEN Gong2, XIANG Wenliang1,*, ZHANG Qing1
(1. Provincial Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan, Institute of Ancient Brewing Technology, College of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Sichuan Academy of Food & Fermentation Industries, Chengdu 611130, China)

The epibiotic lactic acid bacteria (LAB) on the surface of organic radish were investigated by MRS culture, physiological and biochemical characteristics, RAPD, 16S rRNA, antibiotic resistance and phenotype polymorphism. Approximately 4.67 × 103CFU/cm2LAB including 187 isolates colonized on the surface of organic white radish. These isolates were assigned toPediococcus pentosaceus(114/187),Weissella cibaria(9/187),Leuconostoc mesenteroides(18/187),Leuconostoc pseudomesenteroides(7/187),Leuconostoc citreum(20/187) andLeuconostoc holzapfelii(19/187), respectively. And 25 (13.37%) isolates displayed single-drug or multi-drug resistance to tetracycline (TET), streptomycin (STR) and penicillin G (PEN). Of theseP. pentosaceusisolates, 2 had triplicate resistance to STR, TET and PEN, 13 had double resistance to TET and STR, and 4 had single resistance to STR. Of theseL. citreumisolates, 1 had triplicate resistance to STR, TET and PEN, and 1 had the solo resistance to STR. Furthermore, 2L. mesenteroidesisolates with TET resistance and double resistance TET and PEN respectively were found, and on the surface of white radish there were 1L. pseudomesenteroidesstrain and 1W. cibariastrain showing double resistance to STR and TET and double resistance to STR and PEN, respectively.

organic white radish; lactic acid bacteria; tetracycline; streptomycin; penicillin G; antibiotic resistance

TS201.3

1002-6630（2015）11-0145-05

10.7506/spkx1002-6630-201511028

2014-07-29

教育部春晖计划项目（Z2014061）；四川省应用基础项目（2014JY0045）；四川省教育厅重点项目（14ZA0110）；四川省泡菜产业链项目（2012NZ0002-8）；四川省食品生物技术重点实验室项目（SZJJ2014-007）

林凯（1989—），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物分子生态。E-mail：biokailin@sina.com

*通信作者：向文良（1973—），男，副教授，博士，研究方向为中国西南地区特色发酵食品微生物分子生态与生物过程学。E-mail：xwllm7687@sina.com