鸭Ⅰ型肝炎病毒一步法RT-LAMP可视化快速检测方法的建立

胡 成， 朱善元， 左伟勇， 王安平， 吴 双， 洪伟鸣， 成大荣， 马丽丽，王永娟

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009;2.江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300;3.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070)

鸭 I型肝炎病毒(Duck hepatitis virus type I，DHV I)是一种高致死性、高传播性的病毒性传染病病原［1］。该病毒传播迅速，主要侵害4周龄以内的雏鸭。病雏鸭的特征为意识紊乱，急性肝炎，肝脏肿大，有出血斑点［2-3］。在新疫区，本病的死亡率很高，可达90%以上，是危害养鸭业发展最为严重的传染病之一［4］。

DHV I的传统检测方法有血清中和试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，这些检测方法虽然可以对病原做出诊断，但是存在灵敏性不高，试验时间长，重复性低，不易标准化等缺点，在实际应用中有一定的局限性［5-7］。目前，已建立的RT-PCR和荧光定量RT-PCR检测方法，虽然灵敏性相对较高，但是需要使用昂贵的仪器和试剂，专业的人员，试验周期较长，不能适应基层兽医站和养殖场简便易行快速检测的需要［8-9］。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是2000年由日本荣研化学株式会社开发的一种新型的恒温核酸扩增方法［10］。该技术依赖于能够识别靶序列上特异区域的引物和一种具有解旋功能的Bst DNA聚合酶，能够在等温条件下，短时间内实现核酸的指数级扩增［11］。以其简单、快速、高效、灵敏、特异等诸多优点［12-14］受到越来越多兽医工作者的关注。在一些病原微生物的检测中已经开始得到推广应用［15-18］。目前，国内尚无针对鸭I型肝炎病毒的一步法快速RT-LAMP检测方法。因此本研究设计了一套特异性引物，拟建立了DHV I的可视化检测方法，为研制DHV I的快速检测试剂盒打下基础。

1 材料和方法

1.1 病毒株

鸭I型肝炎病毒(DHV I AV2111)购自中国兽医药品监察所;新城疫病毒(NDV)、番鸭细小病毒(MDPV)、小鹅瘟病毒(GPV)和鸭瘟病毒(DPV)株均由本实验室分离、鉴定并于-80℃保存。

1.2 试剂及器材

MgSO4、Bst DNA 聚合酶(大片段)、Betaine和SYBR Green I染料购自New England Biolabs公司;RT-PCR检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;病毒基因组提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司;限制性内切酶 SphI、DNA marker购自TaKaRa公司;dNTP、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC水购自Sigma公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中登录的多条DHV I的基因序列，选取一段高度保守的区域(VP1蛋白基因序列:EF442073.1)，使用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计多套LAMP引物，其中包括2条外引物F3和B3;2条内引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2);2条环引物LF和LB，分别识别保守区域8个基因位点。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成(表1)。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers

1.4 病毒核酸的提取

参照生工柱式病毒抽提纯化试剂盒说明书及相关文献记载［19］，分别提取鸭I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的基因组，取1 μl样品利用分光光度仪测定病毒总含量，少量分装，于-80℃保存备用。

1.5 RT-LAMP反应体系的建立及优化

1.5.1 镁离子浓度的优化 镁离子终浓度为3.5～6.0 mmol/L，以0.5 mmol/L梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.2 引物浓度的优化 由于外引物对试验结果影响很小，所以试验中参照文献数据固定外引物，对内引物终浓度为 0.8 ～ 2.4 μmol/L，以 0.4 μmol/L梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.3 dNTPs浓度的优化 dNTPs终浓度为0.8～1.8 mmol/L，以0.2 mmol/L梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.4 甜菜碱浓度的优化 由于甜菜碱具有稳定酶活性的作用，同时又可以增强反应的特异性，甜菜碱终浓度为0.2～0.7 mol/L，以0.1 mol/L梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.5 反应温度的优化 以DHV AV2111 RNA为模板，反应温度为61～66℃，以1℃梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.6 最佳反应时间的确定 反应时间为15～90 min，以15 mim梯度依次递增，重复进行3次平行反应。

1.5.7 扩增产物的检测 反应结束后肉眼直接观察反应管是否有混浊(短暂离心后可使焦磷酸镁沉于管底，更利于观察);吸取10 μl反应液于1.5%琼脂糖凝胶电泳观察;向剩余15 μl反应液中加入0.5 μl SYBR Green I染料辅助观察。

1.5.8 扩增产物的酶切鉴定 用SeqBilder软件分析RT-LAMP目的片段中的酶切位点，并筛选出单一的SphI(位点GCATG/C)限制性内切酶。20 μl酶切体系如下:SphI(10U)1 μl，10 × 缓冲液 H 2 μl，RT-LAMP产物 5 μl，超纯水 12 μl ，37 ℃ 反应 2 h。取10 μl的酶切产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳观察。

1.6 RT-PCR方法的建立

参照一步法RT-PCR检测试剂盒说明书。加入引物F3和 B3及模板 RNA各1 μl。反应体系为25 μl，于PCR仪上按如下程序进行扩增:45℃孵育45 min;94℃预变性5 min;94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环;72℃延伸7 min。

1.7 RT-LAMP的灵敏性检验

将抽提的DHV I核酸模板进行10倍系列稀释成 10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl等 8 个浓度梯度。对各浓度RNA模板分别用所建立的RT-LAMP和RT-PCR检测方法进行灵敏性对比试验。

1.8 RT-LAMP的特异性试验

分别用抽提的鸭I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒基因组，按照所建立的鸭I型肝炎病毒RT-LAMP检测方法，进行特异性试验。

1.9 RT-LAMP重复性和稳定性试验

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分别提取RNA进行RT-LAMP检测，观察结果。取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，对每一代次重复3次进行RT-LAMP检测，观察结果，以确定该检测方法的重复性和稳定性。

2 结果与分析

2.1 RT-LAMP反应条件

通过对各反应条件的调整优化，最终确定RT-LAMP反应体系为25 μl:包括Bst DNA聚合酶(8 U/μl)1.0 μl、10 × Bst Buffer 2.5 μl、dNTPs(10 mmol/L)3.5 μl、Betaine(5 mol/L)2.0 μl、MgSO4(25 mmol/L)4.0 μl、AMV(5 U/μl)1.0 μl、Inhibitor(40 U/μl)1.0 μl、FIP/BIP(20 μmol/L)2.0 μl、F3/B3(20 μmol/L)0.5 μl、LF/LB(20 μmol/L)0.2 μl、模板 RNA 1.0 μl，加 DEPC 水补足至 25 μl。充分混匀。反应程序:63℃反应45 min，85℃灭活5 min。

2.2 最佳反应时间

在反应进行45 min后，电泳检测有明显的条带，且随着时间延长，条带亮度并没有显著增强，因此选择45 min为最佳反应时间(图1)。

2.3 特异性

2.3.1 产物酶切鉴定 用限制性内切酶SphI对RT-LAMP产物进行酶切鉴定，出现与预期大小218 bp相符合的酶切产物条带(图2)。

2.3.2 特异性检验 采用本试验建立的RT-LAMP方法进行检测，只有以DHV AV2111的RNA为模板时，结果为阳性(肉眼观察反应管可见乳白色浑浊，加入SYBR Green I染料后呈现翠绿色，1.5%琼脂糖凝胶电泳呈现特异性梯形条带)，而以新城疫病毒、番鸭细小病毒、小鹅瘟病毒和鸭瘟病毒的DNA/RNA为模板进行检测时，结果均为阴性(肉眼观察反应管清亮透明、无乳白色浑浊，加入SYBR Green I染料后呈现橘红色，1.5%琼脂糖凝胶电泳无特异性梯形条带出现)(图3)，表明该方法的特异性良好。

图1 最佳反应时间的确定Fig.1 Determination of the best reaction time

图2 DHVⅠRT-LAMP扩增产物酶切鉴定Fig.2 Results of the specificity of DHVⅠRT-LAMP assay

2.4 灵敏性

所建立的RT-LAMP对DHV RNA的最低检测限为10 fg(图4)，而常规RT-PCR方法最低检测限为1 pg(图5)，建立的 RT-LAMP敏感性比常规RT-PCR高约100倍。

图3 RT-LAMP方法检测DHVⅠ的特异性Fig.3 Specificity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

图4 RT-LAMP方法检测DHVⅠ的灵敏性Fig.4 Sensitivity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

图5 RT-PCR方法检测DHVⅠ的灵敏性Fig.5 Sensitivity of RT-PCR assay for DHVⅠ

2.5 重复性和稳定性

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分别提取RNA进行RT-LAMP检测，结果显示，5份检测结果均没有明显差异;取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，对每一代次重复三次进行RT-LAMP检测，结果显示，3次重复间没有明显差异。

3 讨论

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭的一种具有高度传播性、高度致死性传染病。DHV分为I型、II型和III型，三个型之间无交叉保护作用。I型DHV呈现世界性分布，并常和其他病毒、细菌混合感染，对养鸭业危害严重，造成了巨大的经济损失［20-21］。本研究建立的DHV I检测方法对基层和临床快速诊断和疾病处置具有一定的指导意义。

LAMP技术是一种新型核酸扩增技术。与其他检测方法相比，该方法具有特异性强，灵敏度高，扩增高效、快速，步骤简单等诸多优点。该技术主要利用了Bst DNA聚合酶在特异性引物的存在下于61～66℃具有解旋功能和瀑布式扩增功能，在等温的情况下即可实现核酸的变性与扩增。LAMP的关键点是引物设计和评估，需要设计出针对基因保守片段的6条引物且识别8个特异性的位点。常规的LAMP只需要 F3、B3和 FIP(F1c+F2)、BIP(B1c+B2)即可实现目的基因的扩增［22-24］。但是为了提高反应效率，加快检测速度，本研究在F1c+F2之间增加了LF引物，在B1c+B2之间增加了LB引物，大大提高了LAMP的反应速度，在30～45 min即可实现目的基因的扩增检测。

本研究分别利用肉眼颜色观察和琼脂糖凝胶电泳的检测方法对DHV I RT-LAMP反应引物、体系进行检测和分析，得到了高效、特异性扩增DHV I的RT-LAMP引物，最佳的反应体系配比和最短有效反应时间，建立了可视化的检测DHV I的RT-LAMP方法，只有鸭I型肝炎阳性样本能进行核酸的特异性扩增，其他常见家禽病原均不发生非特异性反应;DHV I核酸在该体系中63℃孵育45 min，即可判断结果，比目前的PCR方法更为便捷，且检出限量达到10 fg，显示出极高的灵敏性。

本试验将肉眼沉淀观察法、染料辅助观察法相结合，并分别与琼脂糖凝胶电泳法对比:其中肉眼沉淀观察法在反应产物较少时存在假阴性的可能，而SYBR Green I染料辅助观察法与琼脂糖凝胶电泳结果高度一致，说明SYBR Green I染料辅助观察法可作为一种检测方法，这样不仅省去了传统的琼脂糖凝胶电泳的过程，节省了时间和费用，同时也保护了环境和操作人员，更加方便基层和现场快速检测。

本试验建立的DHV I RT-LAMP检测方法简便、快速、灵敏、特异，具有较高的实用性，适合在基层兽医站和养殖场推广使用，为DHV I的综合防治和早期诊断提供了便利。

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