GDF9和FST调控猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育

彭中友， 孙俊铭， 李 燕， 刘庆友， 于建宁， 施振旦

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所/动物品种改良与繁育重点实验室，江苏 南京 210014;2.贵州省畜牧兽医学校，贵州 贵阳550018;3.广西大学动物科学学院，广西 南宁 530004)

人工辅助生殖技术主要依赖卵子体外成熟(IVM)技术发展而来，IVM技术能避免超数排卵中外源激素刺激造成的副作用，如卵巢过度刺激综合征［1-4］，但与体内成熟卵子比较，IVM卵子发育潜力明显不如体内成熟卵子，IVM卵子受精率和胚胎存活率都低于体内卵子［5］。由此国内外对动物卵母细胞IVM条件、体外受精条件和胚胎体外培养条件进行了大量的研究优化，并在牛和小鼠卵子IVM和胚胎早期发育方面取得较好进展［2，6-8］，但在猪的胚胎体外生产方面仍然面临2个主要问题，一是体外多精受精率高，二是体外受精卵子发育至囊胚比例低和体外胚胎发育质量低于体内发育胚胎质量［9-11］。

卵泡在发育过程中，卵子及其周围的颗粒细胞存在相互双向调控。卵母细胞通过旁分泌方式分泌系列生长因子如BMP、GDF9和活化素等作用于颗粒细胞促进其增殖［12］、分化［13］、代谢、凋亡［14］及卵丘扩展等［15］，其中GDF9在卵泡发生过程和早期胚胎中表达［16］，对卵巢和卵泡发育有重要调控作用［17-20］。卵泡液中GDF9含量与卵子核成熟和胚胎质量具有显著正相关性［21］。在卵母细胞IVM培养过程中添加GDF9能显著提高卵子成熟和早期胚胎的发育能力，这一作用在牛［6，8］与小鼠［2，7-8］上均得到证实，Gomez等［22］将猪卵母细胞-卵丘细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes，COCs)与 能 分 泌GDF9的裸卵(DOs)共同培养发现DOs提高了孤雌激活后COCs中卵母细胞发育至囊胚的比例，但直接向猪卵母细胞IVM培养过程中添加GDF9是否能提高猪卵子成熟和早期胚胎的发育能力尚未见报道。

在卵丘细胞对卵子成熟的影响中，卵丘细胞分泌的FST特异性结合活化素(Activin，ACT)、BMP15甚至GDF9，降低这些转化生长因子的生物活性，抑制卵母细胞的发育与成熟［7，23］。如 Silva 等［24］在牛成熟培养液中添加FST，剂量依赖性地抑制了胚胎发育。我们之前的研究结果表明，利用抗FST抗体处理体外培养的水牛卵母细胞，可以显著提高卵母细胞的成熟率及孤雌胚的发育［25］。Shi等［26］研究发现GDF9能够抑制人颗粒黄体细胞FST的分泌。故推测GDF9可能是通过抑制FST的分泌而促进囊胚的发育，以及当IVM培养液中同时添加GDF9与抗FST抗体时，两种因子可能存在提高胚胎发育的加性效应。

本研究以猪卵母细胞为模型，选用了2个单因子试验和2个二因子有重复交叉分组的试验设计方式，通过向猪卵母细胞成熟培养液中单独添加GDF9，或者同时添加GDF9与FST、GDF9与抗FST抗体，以研究GDF9和FST对卵子成熟和胚胎发育的生物学作用，为最大程度提高猪的体外胚胎生产质量和效率提供理论和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 猪卵母细胞的采集和IVM培养

从屠宰场采集新鲜猪卵巢，置于30～33℃灭菌生理盐水中，2 h内送达实验室。用带有18号针头的10 ml注射器抽取卵巢表面直径为2～6 mm的卵泡，将抽取液放入15 ml离心管中。让COCs自然沉降15 min，用含2%FBS的TCM199洗涤沉降物2～3次。实体显微镜下挑选胞质均匀且至少有3层完整颗粒细胞包围的COCs，用成熟培养液洗涤3次，再用成熟培养液(TCM-199+10%猪卵泡液+10 UI/ml eCG+10 UI/ml hCG+0.6 mmol/L半胱氨酸)洗涤3次后进行成熟培养。液滴式培养，液滴大小为150 μl，每滴内培养 40～50枚卵母细胞，培养条件为39℃，5%CO2的空气，饱和湿度。培养22 h后换成不含激素的成熟培养液继续培养20～22 h。

GDF9和抗GDF9抗体对猪卵母细胞成熟和胚胎早期发育的影响采用单因子试验:卵子IVM过程中，对照组使用基础培养液培养，试验组3份培养液中GDF9的添加浓度分别为100 ng/ml、200 ng/ml和300 ng/ml，另3份培养液中抗GDF9抗体的浓度分别为 2.5 μg/ml、5.0 μg/ml和 10.0 μg/ml;GDF9(0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml)与 FST(0 μg/ml、0.1 μg/ml、1.0 μg/ml)或 抗 FST 抗 体 (0 μg/m、50 μg/ml、100 μg/ml)的共同作用采用2因子交叉分组试验设计。抗GDF9抗体和抗FST抗体由江苏省农业科学院畜牧研究所动物品种改良与繁育重点实验室制备保存，其制备方法见之前发表文献［25］、［27］;GDF9和FST购自R＆D公司，其余试剂均购自Sigma公司。

1.2 卵母细胞孤雌激活和早期胚胎培养

将培养44～45 h的卵丘-卵母细胞复合体移入0.1%透明质酸酶中消化，去除卵丘细胞，挑选排出第一极体且胞质均匀的卵母细胞。然后用电激活液清洗融合槽3～4遍，将卵母细胞在电激活液中清洗2～3遍并静置2～3 min，然后移入覆盖满电激活液的融合槽中，互相间有空隙的一字排开，再以1.0 kV/cm 80 μs 3DC进行电激活。将激活处理过后的卵母细胞于培养液PZM3(含有5 μg/ml细胞松弛素B和10 μg/ml放线菌酮)中化学激活4 h，然后在PZM-3中清洗2～3遍，再置于38.5℃含5%CO2和饱和湿度的二氧化碳培养箱进行连续培养。

1.3 成熟率、卵裂率、囊胚率的统计

培养44 h后的卵母细胞成熟以排出第一极体为标准，并结合成熟卵形态学进行评价。孤雌激活后24 h统计卵裂率，7 d后统计囊胚率。成熟率=成熟卵子数/卵子总数，卵裂率=卵裂数/总卵数，囊胚率=囊胚率/卵裂数。

1.4 囊胚染色及囊胚细胞数统计

参照文献［13］方法用染料Hoechst33342对囊胚进行染色。收集孤雌激活后第7 d对照组和各处理组的囊胚，在洗液中洗3次，然后置于20 μg/ml Hoechst33342的CCM液(Gibco，不含钙镁)中避光室温孵育2 min，再在操作液中洗3次，将囊胚移到载玻片上甘油液滴内，盖上盖玻片并轻轻挤压使细胞平铺，封片后在荧光显微镜(购自Nikon公司)下观察，进行囊胚总细胞计数。

1.5 数据分析

所有试验至少重复3次以上，数据采用分析软件SAS 9.0进行ANVOA分析。

2 结果

2.1 GDF9对猪卵母细胞成熟率、卵裂率和囊胚率的影响

成熟培养液中添加较低浓度(100 ng/ml和200 ng/ml)GDF9对卵母细胞成熟率无显著影响，较高浓度(300 ng/ml)GDF9则显著抑制卵母细胞的成熟(表1);3种浓度GDF9对卵裂率则都无影响。成熟液中添加较低浓度GDF9可以提高囊胚率，将其从对照组的14.7% 显著提高到200 ng/ml处理组的24.8%。当GDF9添加浓度继续提高到300 ng/ml时，囊胚率仅增加到20.2%，与对照组差异不显著。

2.2 抗GDF9抗体对猪卵母细胞成熟率、卵裂率与囊胚率的影响

如表2所示，成熟培养液中添加抗GDF9抗体可以抑制卵母细胞的成熟率和孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率，且抑制作用具有剂量依赖性。

表1 不同浓度GDF9对体外卵子发育能力的影响Table 1 The effects of different concentrations of GDF9 on in vitro oocyte developmental competence

表2 不同浓度抗GDF9抗体对体外卵子发育能力的影响Table 2 The effects of different concentrations of anti-GDF9 antibody on in vitro oocyte developmental competence

2.3 共同添加GDF9和FST对卵子发育能力的影响

成熟培养液中添加不同浓度FST对卵子成熟率和孤雌胚卵裂率无显著影响，但随着FST剂量的增加囊胚率极显著降低，同时囊胚总细胞数显著降低。当向0 μg/ml FST的培养液中分别添加浓度为0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9，囊胚率依次分别为42.8%、42.9%、51.2%，囊胚总细胞数分别为52、47和44;当向0.1 μg/ml FST 的培养液中分别添加浓度为 0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9，囊胚率依次分别为 32.4%、45.5%和35.9%，囊胚总细胞数分别为49、50和50;当向1.0 μg/ml FST 中分别添加 0 ng/ml、100 ng/ml和 200 ng/ml GDF9时，囊胚率分别为24.3%、35.8%和41.2%，囊胚的细胞数依次分别为43、43和46(表3)。由此可见，FST降低了GDF9对胚胎发育的促进作用。

表3 共同添加GDF9和FST对卵子成熟和早期胚胎发育的影响Table 3 The effects of adding GDF9 and FST together in muration medium on oocyte maturation and early embryo development

2.4 共同添加GDF9和抗FST抗体对卵子发育能力的影响

成熟培养液中单独添加抗FST抗体时，增加了囊胚率，呈剂量依赖性，当添加抗FST抗体浓度为100 μg/ml时，囊胚率为 59.9%，与对照组(42.5%)相比差异显著。当向含有抗FST抗体浓度为 50 μg/ml的培养液中分别添加浓度为 0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的 GDF9，囊胚率分别为 53.3%、66.5%和58.2%;当向抗FST抗体浓度为 100 μg/ml的培养液中分别添加浓度为 0 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的 GDF9，囊胚率分别为 59.9%、55.6%、52.8%;与对照组囊胚率(42.5%)相比，培养液中同时添加50 μg/ml抗FST抗体和100 ng/ml GDF9时囊胚率提高到66.5%(表4)，表明共同添加抗FST抗体和GDF9对胚胎发育的促进作用具有明显的加性效应，且抗FST抗体和GDF9最适添加浓度分别为50 μg/ml和100 ng/ml。从表4可以看出，各处理组的成熟率、卵裂率和囊胚总细胞数与对照组相比均无显著差异。

表4 共同添加GDF9和抗FST抗体对卵子成熟和早期胚胎发育的影响Table 4 The effects of adding GDF9 and anti-FST antibody together in maturation medium on oocyte maturation and early embryo development

3 讨论

本研究通过向IVM培养过程中添加GDF9或者抗GDF9抗体，从正反两方面证明了IVM培养液中添加GDF9具有促进猪早期胚胎发育的生物学作用。通过向培养液中同时添加GDF9和FST或者抗FST抗体进一步研究表明，FST降低了GDF9对胚胎发育的促进作用;同时添加GDF9和抗FST抗体对胚胎发育的促进作用具有加性效应。

猪卵母细胞成熟培养液中添加不同浓度GDF9提高了囊胚率，当培养液中添加GDF9浓度为200 ng/ml时囊胚率显著提高，表明猪卵母细胞培养液中GDF9添加的最适浓度为200 ng/ml，但另一方面，GDF9对卵裂率和囊胚细胞数没有显著影响。Gomez等［22］将猪COCs与能分泌 GDF9的裸卵(DOs)共同培养也发现DOs提高了孤雌激活后COCs中卵母细胞发育至囊胚的比例，但对卵裂率和囊胚总细胞数同样没有显著影响。相同的工作在牛卵母细胞培养中也得到了证实［6］。在小鼠卵母细胞培养液中添加GDF9也同样促进了囊胚的发育［2］。这些研究结果都与我们的研究结果一致。我们试验还发现，当培养液中添加抗GDF9抗体时显著降低了囊胚率，而且具有剂量依赖性。Hussein等［7］发现小鼠卵母细胞培养液中添加smad2/3特异抑制剂SB-431542阻断GDF9的下游通路后，显著降低了囊胚发育能力。研究结果表明，GDF9缺陷型小鼠可以形成原始和初级卵泡，但之后卵泡发育受阻，导致完全不育［18，27-28］。这表明卵子分泌的内源 GDF9对卵子进一步发育至成熟发挥着重要的作用，中和内源GDF9或基因沉默内源的GDF9表达都会影响卵子发育及最终成熟。

另外，添加 GDF9浓度为 100 ng/ml或 200 ng/ml时对猪卵子成熟率没有影响，而添加高浓度(300 ng/ml)的GDF9能显著降低成熟率。Clelland等［29］发现同样属于OSFs的BMP15具有抑制斑马鱼卵子成熟的生物学作用。若长期或重度免疫GDF9，会使具有正常生殖机能的母羊卵泡发育停留在初级阶段，而不能发育至次级卵泡阶段以上而导致羊不育;若仅是轻度免疫GDF9，则可以提高母羊的排卵数和产羔数［30］。因此推测过高或过低浓度的GDF9都会抑制卵泡发育。Elvin等［31］研究发现GDF9能够抑制LH受体的表达，推测可能是高浓度GDF9抑制卵子成熟的原因之一。

进一步的研究发现，向IVM培养液中同时添加GDF9和FST或者抗FST抗体时，同时添加GDF9和FST的囊胚率和囊胚总细胞数显著低于同时添加GDF9和抗FST抗体。当向培养液中同时添加GDF9与FST时发现，同时添加各组囊胚率均与对照相比无显著差异，这表明培养液中GDF9减弱了FST对卵子成熟和胚胎发育的抑制作用。当向培养液中同时添加GDF9和抗FST抗体时囊胚率最高达到66.5%，高出对照组(42.5%)和单独添加GDF9组(42.9%、51.2%)或单独添加抗 FST抗体组(53.3%、59.9%)，这表明 IVM培养中同时添加GDF9与抗FST抗体对卵子成熟和胚胎发育的促进作用具有加性效应。IVM培养中卵子周围的卵丘细胞能合成和分泌一些调节因子，例如抑制素(INH)、活化素(ACT)和 FST［21］，在整个 IVM 过程中，这些分泌因子在培养液中不断积累并通过细胞微管影响卵丘细胞的功能和卵子成熟以及后续胚胎的发育。IVM培养液中COCs分泌的ACT、FST和INH的浓度能够达到 100 ng/ml以上［24，32］。培养液中的 ACT能促进卵子成熟和胚胎的发育，而FST和INH亚基却阻碍卵子成熟和胚胎的发育［24，33-38］。FST通过结合ACT阻碍其与受体I和II结合，从而降低ACT的生物学活性［39-40］。同时，FST与ACT的亲和性比对INH的亲和性高出50～100倍［39］。研究结果表明，ACT与FST的比例决定着卵子的成熟质量和胚胎的发育能力［24］。因此免疫FST能增加ACT含量，进而放大ACT下游信号［41-42］，从而促进卵子成熟和胚胎发育［25］。此外，FST也能特异结合 BMP15，成熟培养液中同时添加FST和BMP15发现FST降低了BMP15对卵母细胞成熟和胚胎发育的促进作用［7］。这些结果表明 FST可能通过结合 ACT和BMP15抑制卵子成熟和随后胚胎的发育。Shi等发现GDF9抑制人颗粒黄体细胞中FST的表达［26］。GDF9和抗FST抗体促进卵子成熟和胚胎发育的加性效应可能是因为GDF9抑制了CCs中FST的表达和抗FST抗体有效中和了培养液中的FST。

总之，研究结果证明了GDF9和FST分别对猪卵子IVM成熟及早期胚胎发育具有促进和抑制作用，培养液中共同添加GDF9和抗FST抗体对卵子成熟和胚胎发育的促进作用具有加性效应，这将有助于提高家畜体外胚胎的产量和质量。

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