基于1，8-萘酰亚胺-罗丹明的FRET 机理阳离子探针研究进展

田娟，陈彪，吕浩，吴志兵

(贵州大学 精细化工研究开发中心，贵州 贵阳 550025)

阳离子广泛存在于自然界中，一些阳离子在许多生理过程中起到了重要的作用，如铁离子可作为血红蛋白中氧气的载体，并在许多酶反应中起辅助作用，还有一些阳离子(如汞、铬等)在很低的浓度时就对生物体具有极强的毒性，并是重要的环境污染物［1-4］。因此，对阳离子的识别和检测在生命科学、环境科学等领域中占有重要地位。传统的阳离子检测方法主要有高效液相层析法、质谱分析法、原子吸收光谱法、电感耦合等离子原子发射光谱法等［5-8］，但都需要使用昂贵的仪器，并要准备大量的样品。近年来，由于荧光分子探针具有响应快速、选择性高、灵敏度高等优点，因此成为检测阳离子最方便快捷的方法［9-11］。荧光分子探针的设计原理主要包括以下几类:光诱导电子转移(PET)［12-13］、分子内电荷转移(ICT)［14-15］、单体-激基缔合物［16-17］、荧光共振能量转移(FRET)［18-20］。其中，荧光共振能量转移由于其高的灵敏度及较大的斯托克斯位移而备受人们关注。

荧光共振能量转移是指当一对合适的物质构成一个能量供体和能量受体，当两者相隔距离在1.0～10.0 nm，并且供体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效地重叠，以供体的激发光激发，供体分子由基态跃迁到激发态之后，由于偶极-偶极相互作用，供体分子激发态能量就有可能以非辐射的形式有效地被传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光子而弛豫，这就是荧光共振能量转移过程［21］。常见的荧光团主要有罗丹明、香豆素、荧光素、蒽、芘、萘酰亚胺等，其中罗丹明具有高的消光系数，较高的荧光量子产率，螺内酰胺开环会产生荧光大幅增强的off-on 过程，是一类非常好的荧光染料及FRET 受体;而1，8-萘酰亚胺具有好的稳定性、高荧光量子产率、在4 位和亚胺上易进行结构修饰等优点，是一类重要的荧光团和FRET 供体;且1，8-萘酰亚胺的发射光谱能与罗丹明的吸收光谱有效的重叠，故萘酰亚胺-罗丹明成为受人瞩目的能量供体-受体对［22-25］。

本文根据与不同阳离子的作用进行分类，综述了近年来国内外基于1，8-萘酰亚胺-罗丹明的FRET机理阳离子探针的研究。

1 阳离子探针研究进展

1.1 汞离子探针

Hg2+具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性，这使其成为目前全球最引人关注的环境污染物之一［26］。正是因为Hg2+存在高毒性，因此开发研制成本低、响应快、易实现、能应用于自然环境和生物体系的新型Hg2+检测手段显得尤为重要。

Guo 等［27］以硫脲为连接基团，合成FRET 机理的Hg2+比率荧光分子探针(1)。在探针的甲醇缓冲溶液(10 mmol/L Tris-HCl，2 ∶1，V/V，pH 7.0)中加入Hg2+后，发生荧光共振能量转移使罗丹明开环，形成1，3，4-噁二唑环(见图1)，荧光辐射从540 nm红移到585 nm，荧光辐射增强65 倍，同时溶液颜色由无色变为红色，能量转移效率达到86.3%。荧光滴定实验证明，荧光辐射强度和Hg2+浓度在2 ～10 μmol/L、0.3 ～1 μmol/L 和0.03 ～0.08 μmol/L范围内均呈现出较好的线性关系，具有极高的灵敏度。该探针可在pH 5.7 ～11.0 范围内实现Hg2+检测，除了Ag+和Cu2+对Hg2+检测具有微弱的影响外，其他金属离子均无干扰。

图1 探针(1)与Hg2+的反应机理图Fig.1 The response mechanism of (1)+ Hg2+

Mahato 等［28］设计了一个可检测Hg2+和Cr3+的双探针分子(2)。在探针的乙腈缓冲溶液(1 mmol/L HEPES，1 ∶1，V/V，pH 7.2)中加入Hg2+或Cr3+，发生FRET 过程(见图2)，561 nm 处出现新的吸收峰，583 nm 处出现强的罗丹明的发射峰，溶液颜色由无色变为粉红色，荧光颜色由黄色变为红色。有趣的是在Hg2+的粉红色溶液中加入过量的KI，生成HgI2，溶液颜色消失，继续在此混合溶液中加入Cr3+，溶液又变回粉红色，因此在有过量KI 存在时，探针(2)对Cr3+具有较好的选择性，其他金属离子不产生干扰。Job 曲线表明，探针与Hg2+或Cr3+以1 ∶1 结合。荧光滴定实验证明，探针与Hg2+或Cr3+的结合常数分别为(1. 09 ±0. 02)×105L/mol 和(1.12 ±0.01)×105L/mol，荧光辐射强度比值F583/F533分别增强25.1 和22.75 倍。探针可用于A431细胞中Hg2+和Cr3+的显影成像研究。

图2 探针(2)与Hg2+络合结构示意图Fig.2 The structure of (2)+ Hg2+ complex

Luxami 等［29］报道了一个基于FRET 机理的可逆的荧光分子探针(3)。在空白探针溶液中加入汞离子，可使罗丹明开环产生荧光，585 nm 处的荧光辐射增强了140 倍，荧光颜色由蓝色变为红色，而再在其中加入KI 或生物硫醇(如半胱氨酸)时，又会发生可逆的FRET 现象，使罗丹明闭环，萘酰亚胺恢复荧光(见图3)。选择性实验表明，除铜离子可诱导探针(3)有微弱的荧光增强外，其他金属离子无干扰。此外，探针(3)可以选择性的检测小麦样品中的生物硫醇。

图3 探针(3)与Hg2+络合结构示意图Fig.3 The structure of (3)+ Hg2+ complex

1.2 铝离子探针

Li 等［30］设计了可用于Hela 细胞内Al3+分布显影成像研究的探针(4)。在pH 6.0 ～8.0，加入Al3+后，发生FRET 过程，罗丹明开环(见图4)，该化合物在580 nm 处荧光增强，荧光强度比值F580/F530增强11 倍从0.42 增大至4.88，溶液由无色变为粉红色。Al3+在0. 1 ～50 μmol/L 的 浓 度 范 围 内，10 μmol/L的探针(4)溶液对Al3+的检出限为0.1 μmol/L。探针与Al3+形成1 ∶1 络合，络合常数为7.5 ×104L/mol。选择性实验表明，除了Mn2+有极小的影响外，其他金属离子无干扰。

图4 探针(4)与Al3+络合结构示意图Fig.4 The structure of (4)+ Al3+ complex

1.3 铁离子探针

近年来，Fe3+荧光探针研发突飞猛进，在设计探针分子的过程中，1，8-萘酰亚胺和罗丹明荧光团受到了特别的关注。Thennarasu 等［31］基于FRET 机理，设计了对Fe3+具有高度选择性的荧光分子探针(5)。当向该探针的乙腈缓冲溶液(V ∶V =1 ∶1，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.4)中加入Fe3+，诱导能量从萘酰亚胺转移到罗丹明，使罗丹明开环(见图5)，最大吸收波长从415 nm 红移到560 nm，吸光度增强了458 倍，荧光辐射从532 nm 红移到580 nm，溶液由浅黄色变为粉红色。Job 曲线表明，探针与Fe3+为1 ∶1 络合。探针(1)的荧光辐射强度与铁离子的浓度在0.05 ～10 μmol/L 范围内呈线性关系，Fe3+的最低检出限达到3 ×10－9，并且探针可用于NIT 3T3 细胞内Fe3+的显影检测。

图5 探针(5)与Fe3+络合结构示意图Fig.5 The structure of (5)+ Fe3+ complex

1.4 锡离子探针

Yi 等［32］首次报道了一个可用于检测活细胞内Sn4+的荧光分子探针(6)(见图6)。向探针溶液中分别加入Sn4+、Cu2+和Cr3+时，1 min 内溶液由浅黄色变为红色，在555 nm 处出现最大吸收峰，荧光辐射从523 nm 红移到580 nm，辐射光从浅黄色变为橘黄色，而其他金属离子基本不产生干扰。然而把EDTA 加入(6)+ M(M = Sn4+、Cu2+和Cr3+)溶液中，30 min 内络合体(6)+Sn4+的橘黄色荧光部分褪色，恢复到原始的浅黄色，而络合体(6)+Cu2+和(6)+Cr3+则没有变化，因此该探针可用于实时监控细胞和生物体内的Sn4+。运用紫外可见吸收法，该探针对Sn4+的检出限为11 μmol/L。

图6 探针(6)与Sn4+络合结构示意图Fig.6 The structure of (6)+ Sn4+ complex

1.5 铬离子探针

Li 等［33］基于FRET 机理设计了一个能与Cr3+进行多位点结合的荧光分子探针(7)。探针溶液(C2H5OH/H2O，V/V =2 ∶1)中加入Cr3+后，能量从萘酰亚胺转移到罗丹明，诱导罗丹明开环(见图7)，在568 nm 处出现新的吸收峰，并伴随着溶液颜色由浅黄色变为橘红色。荧光辐射强度比值F592/F544增强7.6 倍从0.77 增大至5.63，探针与Cr3+形成1∶1 络合物，络合常数为9.4 ×103L/mol。该探针对Cr3+体现出很好的选择性，除Mn2+、Ag+和Al3+能诱导探针产生轻微的荧光猝灭或增强外，其他金属离子均无干扰，可用于Hela 细胞中Cr3+的显影成像研究。

图7 探针(7)与Cr3+络合结构示意图Fig.7 The structure of (7)+ Cr3+ complex

1.6 氢离子探针

图8 探针(8)与H +络合结构示意图Fig.8 The structure of (8)+ H +complex

Bojinov 等［34］以4-(N-甲基哌嗪基)-1，8-萘酰亚胺和罗丹明6G 为能量供受体对，设计合成了一个基于FRET 机理的pH 探针(8)。当pH 为8.2 时，由于哌嗪上的N-氨基对1，8-萘酰亚胺的PET 效应，在水-DMF(4 ∶1，V/V)溶液中以390 nm 为激发波长激发1，8-萘酰亚胺，探针只在514 nm 处出现1，8-萘酰亚胺的弱的辐射峰，随着溶液的酸性增强，当pH为2.5 时，PET 效应受到抑制，罗丹明开环(见图8)，在522 nm 处出现新的吸收峰，并在562 nm 处出现强的辐射峰，荧光增强43 倍，能量传递效率达到97%。

Bojinov 等［35］以罗丹明6G 为核心，在其周边引入聚酰胺-胺型树枝状结构，合成了2 个pH 探针(9)和(10)。当pH ＞5 时，罗丹明处于闭环状态，体系为无色，1，8-萘酰亚胺由于分子内电荷转移效应，在380 ～530 nm 有吸收。当pH 2 ～5 时，能量从1，8-萘酰亚胺转移到罗丹明，发生FRET 过程，使罗丹明开环，在534 nm 处出现新的吸收峰，因为探针(10)比探针(9)多2 个能量供体，故534 nm 处的吸光度比探针(9)强2 倍，且在560 nm 处罗丹明的辐射区内，探针(10)和探针(9)的辐射强度各增强了10 倍。

图9 不同pH 时探针(11)与H +络合结构示意图Fig.9 The structure of (11)+ H +complex at different pH

同年，该课题组基于同样的结构，将1，8-萘酰 亚胺4 位上的烷基胺换成哌嗪基［36］，合成了一个含捕光天线的pH 探针(11)。在碱性溶液中，探针哌嗪三级胺上的电子向1，8-萘酰亚胺转移，发生PET效应，使体系荧光猝灭。当溶液pH 2 ～6 时，在510 nm 处激发1，8-萘酰亚胺，发生荧光共振能量转移，使罗丹明开环，探针在560 nm 处出现强的辐射峰(见图9)，且能量转移效率为91%。选择性实验表明，在罗丹明辐射区内过渡金属离子基本无干扰。

Fan 等［37］基于FRET 机理以同样的能量供受体对合成了比率型pH 探针(12)。当pH 为2.00 ～7.20 时，随着酸性的增强，能量从萘酰亚胺转移到罗丹明，使罗丹明开环，538 nm 处萘酰亚胺的辐射峰逐渐减弱，580 nm 处出现新峰，强度逐渐增大，该峰为罗丹明的特征峰，能量传递效率为72%。选择性实验表明，不同的金属离子和氨基酸不干扰H+的检测，该探针对H+具有极高的选择性，可与MCF-7 细胞内的溶酶体结合，用于pH 显像。

2 结束语

基于1，8-萘酰亚胺-罗丹明的FRET 机理阳离子探针具有裸眼识别、响应快、选择性高等优点，通过不同的桥接基团引入多样化的识别基团，并在1，8-萘酰亚胺的四位或亚胺上引入不同的取代基，可实现对阳离子的选择性识别和检测。尽管部分性质优秀的探针已经成功应用于活细胞的显影成像，但是进一步优化已有探针的性能，推进其在生命科学、环境科学等领域的实际应用，开发新型的具有选择性好、对生物体副作用小和对环境友好的荧光分子探针仍是该项研究的重点和难点。

［1］ Yoon S，Albers A E，Won A P，et al. Screening mercury levels in fish with a selective fluorescent chemosensor［J］.J Am Chem Soc，2005，127(46):16030-16031.

［2］ Maity D，Govindaraju T. Naphthaldehyde-urea/thioureaconjugates as turn-on fluorescent probes for Al3+based on restricted C N isomerization［J］. Eur J Inorg Chem，2011(36):5479-5485.

［3］ Tang L，Li Y，Nandhakumar R，et al. An unprecedented rhodamine-based fluorescent and colorimetric chemosensor for Fe3+in aqueous media［J］.Monatsh Chem，2010，141:615-620.

［4］ Wang M，Wang J，Xue W，et al.A benzimidazole-based ratiometric fluorescent sensor for Cr3+and Fe3+in aqueous solution［J］.Dyes Pigm，2013，97(3):475-480.

［5］ Townsend A T，Miller K A，Mclean S，et al.The determination of copper，zinc，cadmium and lead in urine by high resolution ICP-MS［J］. J Anal At Spectrom，1998，13:1213-1219.

［6］ Reddi G S，Rao C R M.Analytical techniques for the determination of precious metals in geological and related materials［J］.Analyst，1999，124:1531-1540.

［7］ Li Y，Chen C，Li B，et al.Elimination efficiency of different reagents for the memory effect of mercury using ICPMS［J］.J Anal At Spectrom，2006，21:94-96.

［8］ Leermakers M，Baeyens W，Quevauviller P，et al.Mercury in environmental samples:Speciation，artifacts and validation［J］.Trends Anal Chem，2005，24:383-393.

［9］ Xu Z，Kim S K，Yoon J. Revisit to imidazolium receptors for the recognition of anions:Highlighted research during 2006 ～2009［J］.Chem Soc Rev，2010，39:1457-1466.

［10］Chen X，Zhou Y，Peng X，et al.Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiols［J］. Chem Soc Rev，2010，39:2120-2135.

［11］Zhou Y，Xu Z，Yoon J.Fluorescent and colorimetric chemosensors for detection of nucleotides，FAD and NADH:Highlighted research during 2004 ～2010［J］. Chem Soc Rev，2011，40:2222-2235.

［12］ Veale E B，Kitchen J A，Gunnlaugsson T. Fluorescent tren-based 4-amino-1，8-naphthalimide sensor for Cu(II)based on the use of the (fluorophore-spacer-receptor)photoinduced electron transfer (PET)principle［J］. Supramol Chem，2013，25(2):101-108.

［13］Voutsadaki S，Tsikalas G K，Klontzas E，et al. A“turnon”coumarin-based fluorescent sensor with high selectivity for mercury ions in aqueous media［J］. Chem Commun，2010，46:3292-3294.

［14］ Mu H，Gong R，Ren L，et al. An intramolecular charge transfer fluorescent probe:Synthesis and selective fluorescent sensing of Ag+［J］.Spectrochim Acta Part A，2008，70(4):923-928.

［15］Veale E B，Gunnlaugsson T，Kruger P E，et al.Demonstration of bidirectional photoinduced electron transfer (PET)sensing in 4-amino-1，8-naphthalimide based thiourea anion sensors［J］.Org Biomol Chem，2009，7:3447-3454.

［16］Chen J，Liao D，Wang Y，et al.Real-time fluorometric assay for acetylcholinesterase activity and inhibitor screening through the pyrene probe monomer-excimer transition［J］.Org Lett，2013，15(9):2132-2135.

［17］Cho Y，Lee S K，Lee J W，et al.Reaction-based Hg2+signaling by excimer-monomer switching of a bis-pyrene dithioacetal［J］. Tetrahedron Lett，2013，54(39):5341-5344.

［18］Zhou Y，Chu K，Zhen H，et al. Visualizing Hg2+ions in living cells using a FRET-based fluorescent sensor［J］.Spectrochim Acta Part A，2013，106:197-202.

［19］Yuan L，Lin W，Zheng K，et al. FRET-based small-molecule fluorescent probes:Rational design and bioimaging applications［J］. Acc Chem Res，2013，46(7):1462-1473.

［20］ Chen Q，Zhang X，Sun Y，et al. Highly sensitive fluorescent protein FRET detection using optofluidic lasers［J］.Lab Chip，2013，13:2679-2681.

［21］乔丽.基于罗丹明及萘酰亚胺衍生物的新型阳离子荧光分子探针的设计与合成［D］.长沙:湖南大学，2009:5.

［22］Kim H N，Lee M H，Kim H J，et al.A new trend in rhodamine-based chemosensors:Application of spirolactam ring-opening to sensing ions［J］. Chem Soc Rev，2008，37:1465-1472.

［23］Beija M，Afonso C A M，Martinho J M G. Synthesis and applications of rhodamine derivatives as fluorescent probes［J］.Chem Soc Rev，2009，38:2410-2433.

［24］Liu B，Tian H.A selective fluorescent ratiometric chemodosimeter for mercury ion［J］. Chem Commun，2005，3156-3158.

［25］ Liu B，Tian H. A ratiometric fluorescent chemosensor for fluoride ions based on a proton transfer signaling mechanism［J］.J Mater Chem，2005，15:2681-2686.

［26］Zhao Q，Cao T Y，Li F Y，et al. A highly selective and multisignaling optical-electrochemical sensor for Hg2+based on a phosphorescent iridium (III)complex［J］.Organometallics，2007，26(8):2077-2081.

［27］Liu Y，Lü X，Zhao Y. A naphthalimideerhodamine ratiometric fluorescent probe for Hg2+based on fluorescence resonance energy transfer［J］.Dyes Pigm，2012，92:909-915.

［28］Mahato P，Saha S，Suresh E，et al.Ratiometric detection of Cr3+and Hg2+by a naphthalimide-rhodamine based fluorescent probe［J］.Inorg Chem，2012，51(3):1769-1777.

［29］Luxami V，Verma M，Rani R，et al.FRET-based ratiometric detection of Hg2+and biothiols using naphthalimiderhodamine dyads［J］. Org Biomol Chem，2012，10:8076-8081.

［30］Li C Y，Zhou Y，Li Y F，et al.Efficient FRET-based colorimetric and ratiometric fluorescent chemosensor for Al3+in living cells［J］.Sen Actuators B，2013，186:360-366.

［31］Chereddy N R，Thennarasu S，Mandal A B. A highly selective and efficient single molecular FRET based sensor for ratiometric detection of Fe3+ions［J］. Analyst，2013，138:1334-1337.

［32］Wang Q，Li C，Zou Y，et al. A highly selective fluorescence sensor for Tin (Sn4+)and its application in imaging live cells［J］. Org Biomol Chem，2012，10:6740-6746.

［33］Zhou Z G，Yu M X，Yang H.FRET-based sensor for imaging chromium (III)in living cells［J］.Chem Commun，2008，3387-3389.

［34］Bojinov V，Venkova A，Georgiev N.Synthesis and energytransfer properties of fluorescence sensing bichromophoric system based on Rhodamine 6G and 1，8-naphthalimide［J］.Sens Actuators B，2009，143(1):42-49.

［35］Georgiev N，Bojinov V，Venkova A.Design，synthesis and pH sensing properties of novel PAMAM light-harvesting dendrons based on rodamine 6G and 1，8-naphthalimide［J］.J Fluoresc，2013，23(3):459-471.

［36］Georgiev N，Asiri A，Bojinov V，et al.A pH sensitive and selective ratiometric PAMAM wavelength-shifting bichromophoric system based on PET，FRET and ICT［J］.Dyes Pigm，2014，102:35-45.

［37］Fan J，Lin C，Li H，et al.A ratiometric lysosomal pH chemosensor based on fluorescence resonance energy transfer［J］.Dyes Pigm，2013，99(3):620-626.