马兰叶总黄酮的提取及其含量的测定

顾霞敏，许海丹，梁丹霞

(台州学院 医药化工学院，浙江 临海 317000)

马兰［Kalimeris indica (Linn.)Sch.］为菊科马兰属多年生草本植物，中国南方各地有分布。在我国，部分地区马兰作为草本花卉栽培，是兼有食用、药用的多用经济植物。马兰中营养丰富，含有氨基酸、黄酮、多糖、矿物质等多种营养成分［1-2］，具有镇痛、抗炎等功效［3］。黄酮类化合物具有抗氧化、抗病毒、增强人体免疫能力等［4-5］多种生物活性。目前，国内外对马兰黄酮化合物的研究报道相对还较少，报道中，马兰总黄酮含量的测定多为NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 体系的紫外分光光度法［6-9］，该法存在显色繁琐、操作复杂、检测时间长等不足。

本实验建立AlCl3显色法测定马兰叶总黄酮的含量，并以黄酮提取率为考察指标，优化马兰叶总黄酮的超声提取工艺，从而为马兰总黄酮进一步开发提供指导。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

新鲜马兰叶;芦丁标准品(批号100080-200707)，来自中国药品食品检定研究院;甲醇、乙醇、石油醚(60 ～90 ℃)、AlCl3·6H2O 均为分析纯。

UV-2401PC 岛津紫外分光光度计;中草药粉碎机;RE-52AA 旋转蒸发器;KQ-500DE 型医用数控超声波清洗器。

1.2 马兰叶的预处理

新鲜马兰叶用清水洗净，105 ℃杀青20 min，80 ℃下真空干燥至恒重，粉碎过60 目筛。将干燥粉末分批于索氏提取器中，用石油醚脱脂处理。脱脂后，挥去石油醚，即为马兰叶脱脂粉末，脱脂粉末质量约占原干燥粉末60%。将脱脂粉末保存于干燥器中，备用。

1.3 溶液制备

1.3.1 芦丁标准溶液的配制 精密称取于120 ℃干燥至恒重的芦丁50. 0 mg，加甲醇适量，超声溶解，放冷，用甲醇定容至50 mL，即为1 mg/mL 的芦丁标准溶液。

1.3.2 样品溶液的制备 称取马兰叶脱脂粉末1.0 g 于锥形瓶中，加90%乙醇50 mL，70 ℃超声提取2 次，每次40 min［10］。抽滤，合并两次滤液，减压浓缩除去溶剂，用甲醇溶解，并定容至25 mL。

1.4 马兰叶总黄酮含量的测定

移取一定量的芦丁标准溶液或样品溶液于10 mL 容量瓶中，加入1%AlCl3-甲醇溶液2 mL，用甲醇稀释至刻度。摇匀、显色15 min 后，以空白试剂作参比，在418 nm 波长处读取吸光度。

1.5 马兰叶总黄酮的提取

称取1.0 g 马兰叶脱脂粉末于锥形瓶中，加入试剂浸泡30 min，使粉末充分浸润，进行超声提取。提取液减压浓缩除去溶剂，用甲醇溶解并定容至25 mL。马兰叶总黄酮提取率按下式计算:

2 结果与讨论

2.1 马兰叶总黄酮含量的测定方法

2.1.1 检测波长的选择 分别移取1 mL 的芦丁标准溶液和样品溶液，按实验方法显色15 min 后，在300 ～600 nm 进行扫描，见图1。

图1 芦丁与样品溶液吸收谱图Fig.1 Absorption spectra of rutin and sample solution 1.芦丁标准溶液;2.样品溶液

由图1 可知，确定检测波长为418 nm。

2.1.2 显色剂用量的确定 按实验方法分别取芦丁标准溶液与样品溶液各1 mL，分别加入显色剂1% AlCl3-甲醇溶液0 ～9 mL(间隔1 mL)，用甲醇定容至10 mL，在418 nm 处测定吸光度值。结果表明，在0 ～2 mL，吸光度值随显色剂用量的增加而显著增加，2 ～9 mL 吸光度值变化幅度不大。因此，确定显色剂用量为2 mL。

2.1.3 显色时间的选择 各取标准溶液与样品溶液1 mL，加入2 mL 显色剂，甲醇定容至10 mL。每隔1 min 在418 nm 处测定吸光度。结果表明，样品溶液与标准溶液，显色15 min 后，吸光度几乎维持稳定。

2.1.4 线性关系 把芦丁标准溶液稀释成表1 中的浓度，按实验方法，取1 mL 检测吸光度。以吸光度A 为纵坐标，浓度C 为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为:A =17.355C +0.002 1，R2=0.998 6，表明浓度在0.004 ～0.100 mg/mL，有良好的线性关系。

表1 芦丁标准溶液浓度与吸光度Table 1 Rutin standard solution concentration and absorbency

2.1.5 方法学验证

2.1.5.1 精密度 取样品溶液5 份，按上述实验确定的参数测定吸光度，得RSD =0.487%，表明该方法精密度良好。

2.1.5.2 稳定性 取1 份样品溶液，显色15 min后，分别测定在0 ～90 min(间隔10 min)内吸光度。RSD=0.407%，表明该显色反应至少在90 min 内是稳定的。

2.1.5.3 重复性 对同一批马兰叶脱脂粉末5 份，按上述方法提取、分析，得RSD =2.07%，说明该方法重复性良好。

2.1.5.4 加样回收率 取5 份样品溶液各1 mL，分别添加已知含量的芦丁标准溶液，测定总黄酮量。得平均加样回收率为97.4%，RSD=0.96%。

2.2 马兰叶总黄酮超声提取工艺优化

2.2.1 正交实验结果 因素水平见表2，结果见表3。由表3 可知，影响马兰叶总黄酮超声提取的主次顺序为:A(提取温度)＞C(乙醇体积分数)＞B(提取时间)＞D(料液比)，最佳方案为A3B3C2D2，即提取温度50 ℃，提取50 min，乙醇体积分数80%，料液比1/50(g/mL)。

表2 正交因素水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal design

表3 正交实验结果Table 3 Orthogonal experimental results

2.2.2 优选条件的验证 在最佳条件下超声提取马兰叶总黄酮，平行操作3 次，平均提取率为7.01%，RSD =1.64%。可见A3B3C2D2条件下，黄酮提取率均高于表3 中的每项实验结果，该条件为最佳选择。

3 结论

(1)建立了以1% AlCl3-甲醇溶液为单一显色剂，紫外分光光度法快速测定马兰叶总黄酮含量的方法，该方法简便、结果可靠。

(2)马兰叶总黄酮的超声提取最优条件为:乙醇体积分数80% 提取，料液比1 ∶50(g/mL)，在50 ℃提取50 min。在此条件下，总黄酮的提取率为7.01%。

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