新型产琼胶酶海洋细菌的筛选和鉴定

刘丽莉+祖国仁

摘要：从大连沿海的50份石花菜中筛选出相对酶活较高的83株产琼胶酶菌株（酶活力测定采用3， 5 - 二硝基水杨酸法），挑选琼胶酶活力最高的菌株并通过形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析研究其分类地位。结果表明，该菌株（暂命名为ZGR-26）为革兰氏阴性杆菌，与食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）序列同源性达到99%，两者生理生化特性基本相符，可初步确定为食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）。筛选得到了新型的产琼胶酶海洋细菌——食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans），分泌琼胶酶活力较高（32.1 U/mL），为微生物降解法生产琼胶寡糖提供了新的出发菌株。

关键词：琼胶酶;筛选与鉴定;16S rRNA;食琼胶弧菌（Vibrio agarivorans）

中图分类号：Q939        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）20-4831-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.015

Screening and Identification of A Novel Marine Bacterium Producing Agarase

LIU Li-li， ZU Guo-ren

（ School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China）

Abstract： 83 agarase-producing strain with high enzyme activity were screened from 50 samples of Gelidium in Dalian coast by DNS method. The morphology， physiological characteristics and 16SrRNA sequence of the strains were identified to characterize its classification status. The results showed that the strain （named as ZGR-26） was Gram negative bacilli， had 99% homology and consistent physiological and biochemical characteristics with Vibrio agarivorans. The screened novel marine agarase-producing bacteria was identified as Vibrio agarivorans. The activity of producing agarase reached to 32.1 U/mL. It will provide a initial strain to agar- oligosaccharides manufacture by bio-degradation.

Key words： agarse; screening and identification;16SrRNA;Vibrio agarivorans

琼脂又称琼胶，是一组海藻多糖的总称，由半乳糖和3，6—内醚—L-半乳糖通过1—3和1—4糖苷键交替连接的长链，在C6上被硫酸酯化，是一类含硫酸酯的半乳聚糖[1]。天然琼胶是一种从海洋藻类细胞壁中提取出来的多糖，其水解产物琼胶低聚糖或琼胶寡糖在食品和医药领域应用广泛。琼胶寡糖不受肠道内细菌分解以及无热量产生，因而可作高甜味剂的填充剂及分散剂用于饮料、面包及低热量食品的生产[2]。琼胶寡糖通过阻止可诱导性NO合成酶（iNOS）的表达来抑制过量NO自由基的产生，从而消除一些因NO过量而造成的关节炎等炎症[3]。此外琼胶低聚糖ML对自由基有很好的清除作用，小鼠试验表明中分子琼胶低聚糖（ML）可保护抗氧化酶SOD和GSH—Px的活力，对肝损伤有良好的保护作用[4]。目前琼胶寡糖的获取途径主要是通过化学降解法和酶解法，化学降解法存在条件难控制、产物不均一、产物分析和回收难等问题。用微生物分泌的琼胶酶水解琼胶制备琼胶寡糖，不仅反应条件温和，能耗低，且酶催化具有高效性和专一性，选择性地切断糖苷键，可克服化学降解法存在的问题[5]。

目前绝大部分琼胶酶来源于海洋生态系统中的海洋细菌，这类微生物分布范围非常广且其产酶量大。刘江涛等[6]从江蓠中分离得到了两株多食鞘氨醇杆菌;田国强等[7]发现红藻门江蓠和石花菜中共生有Agarivorans、Cellulophaga、Alteromonas、Saccharophagus、Glaciecola、Vibrio 6个属的具有降解琼胶能力的海洋细菌;除了在海洋生态系统以外，降解琼胶的菌类也同样存在陆地生态系统中，Suzuki 等[8]在日本岐阜地区的土壤中分离到一株能够产生α-新琼寡糖水解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.MK03） 。这些已发现的海洋细菌降解琼胶能力普遍偏低，还远未能达到工业化生产琼胶寡糖的需求，这也成为阻碍生物法制备琼胶寡糖的瓶颈，本研究从海洋微生物中分离出高效降解琼胶的菌株，为今后开发利用海洋细菌细胞内的多糖降解酶和对应的功能基因生产功能性寡糖奠定基础;同时，为进一步研究凝胶的寡糖成分、寡糖活性创造条件。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株来源  大连黑石礁沿海海域自然生长的石花菜。分离培养基（2216E）：蛋白胨5 g，酵母膏1 g，磷酸高铁0.01 g，琼脂20 g，陈海水1 000 mL，pH 7.2～7.8，121 ℃，20 min 灭菌后倒平板。种子培养基：琼脂1 g，其他成分同分离培养基。发酵培养基：同种子培养基。

1.1.2  主要试剂及仪器  琼脂及其他化学试剂均来自北京奥博星生物技术有限责任公司。JSM-460LV型扫描电镜（英国牛津仪器公司），722型光栅分光光度计（上海分析仪器厂）。

1.2  方法

1.2.1  产琼胶酶海洋细菌的分离  将采集的50份石花菜样品用剪刀将其剪成细小碎片，置于含有玻璃珠的海水中振荡30 min，取不同稀释梯度的菌悬液涂布在分离培养基，28 ℃培养观察。以能产生琼脂凹陷圈为标准，挑取凹陷圈较大的菌株，单菌落斜面保藏以筛选产琼胶酶性能优良菌株。

1.2.2  产琼胶酶性能优良菌株的筛选  挑取筛选菌株一环，接入装有5 mL种子培养基的大试管中， 28 ℃，150 r/min摇床培养24 h后，转接到装有30 mL/100 mL发酵培养基的三角瓶中，28 ℃，150 r/min摇床培养48 h，取培养液于8 000 r/min离心5 min后，上清液以DNS法（3， 5 - 二硝基水杨酸法）[9]测量琼胶酶活力。DNS法琼胶酶活力测定方法：取1 mL发酵上清液和1 mL磷酸缓冲液（琼脂0.2 g/L，pH 7.0）于试管内，于40 ℃温浴30 min后加入2mL DNS试剂，混合液在沸水中水浴10 min后用去离子水定容至25 mL，充分混匀后在540 nm处测量吸光度值。酶活力定义：以煮沸灭活的上清液为空白对照，以1 mL酶液1 min产1 μg还原糖定义为1个活力单位。

1.2.3  产琼胶酶海洋细菌的电镜形态观察  电子扫描电镜观察细胞形态。

1.2.4  产琼胶酶海洋细菌鉴定  菌株的形态学和生理生化特性的测定： 根据《常见细菌系统鉴定手册》所列菌种鉴定的方法进行菌种的鉴定[10]。菌株的16S rRNA基因序列测定和分析： ① 16S rRNA基因序列测定：由宝生物工程有限公司完成。②16S rRNA基因序列结果分析：将所得到的基因序列利用BLAST软件与GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库进行序列比对， 获取相近典型菌株的16S rRNA基因序列， 采用ClustalX和MEGA软件包进行分析， 用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树， 进行系统发育分析， 各枝上的数字是1 000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比[11-13]。

2  结果

2.1  细菌分离结果

从50份石花菜样本中分离得到83株菌株，根据琼脂凹陷圈大小得到具有较明显分解琼脂能力的菌株30株（图1A），经卢哥氏碘液染色后产生透明圈（图1B）。

2.2  高产琼胶酶菌株的筛选

以初步分离得到的30株菌株为出发菌株，测得其48 h琼胶酶活力（表1）。其中酶活力平均值在10以上的菌株有15株，酶活力最高菌株为ZGR-26菌株，达到32.1。由于这些菌株的菌落形态较为相似，认为是同一种菌，所以选取产酶活力最高的ZGR-26菌株进行鉴定。

2.3  产琼胶酶菌株ZGR-26的形态、培养特征及理化特性

琼胶酶产生菌ZGR-26在2216E固体培养基培养48 h后观察， 菌落呈扁圆形凸起， 光滑， 比较湿润， 白色或淡黄色，透明，边缘整齐， 无可溶性色素， 周边分解琼脂产生透明凹陷。电镜观察， 细胞短杆状，（1.0～1.5） μm×（1.5～2.0） μm， 无芽孢， 革兰氏染色阴性（图2）。

ZGR-26的部分生理生化特征见表2。将该菌株与V. agarivorans进行生理生化特征鉴定比较， 结果表明菌株ZGR-26所测定的生理生化反应与V. agarivorans作为属间种的鉴别的特征基本相符（但是ZGR-26能利用蔗糖作为碳源，而V. agarivoran则不能），由此初步鉴定该菌为食琼胶弧菌。

2.4  16S rRNA基因序列分析

将扩增得到的16S rRNA基因片段电泳检测， 测得其序列长度为1 458 bp。经BLASTn软件序列分析， 结果表明细菌ZGR-26 （KF612972）与食琼胶弧菌（V. agarivorans）同源性最高（表3）。从GenBank中选取和菌株ZGR-26同源性较高的8株菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育进化树， 结果显示，ZGR-26的遗传进化距离与食琼胶弧菌（V. agarivorans）最近， 并在同一分支中，而与此前发现较多的噬琼胶菌（Agarivorans albus）进化距离较远，不在同一进化分支中（图3）。根据菌株的形态学特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析， 初步鉴定细菌ZGR-26为食琼胶弧菌（V. agarivorans）。

3  讨论

国内外对于能降解琼胶的海洋细菌的研究主要集中在噬琼胶菌（Agarivorans albus）上，其中从荣螺肠道中分离得到的噬琼胶菌株琼胶酶基因已经被测定出来，并在宿主大肠杆菌中得到成功表达[14]。本试验从石花菜中筛选得到了30株菌株的琼胶酶活力，其中菌株ZGR-26酶活力达到32.1。经16S rRNA基因序列分析表明，与已报道有明显降解琼脂能力的噬琼胶菌（Agarivorans albus）进化距离较远，而与食琼胶弧菌（V. agarivorans）最为接近。菌株生理生化特征结果表明ZGR-26除了在利用蔗糖能力上与食琼胶弧菌有所差别，其他特征基本一致，可以确定ZGR-26为食琼胶弧菌（V. agarivorans）。此类琼胶降解菌国内首次发现，国外仅Macisn等[15]从大西洋海水及蚌类中分离出食琼胶弧菌（V. agarivorans），这为微生物生态多样性研究奠定了基础，这也为生物制备琼胶寡糖提供了更为广泛的研究材料，为大量制备高纯度的低聚糖创造条件，在寡糖的基础及应用研究方面提供技术支撑，以及为海洋寡糖类创新药物的研究开发以及其相关产业的发展奠定理论基础，对推动糖生物学和化学研究的深入开展具有重要意义。

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