八角莲中鬼臼毒素的含量测定技术

孙海峰

黑龙江珍宝岛药业股份有限公司鸡西分公司

八角莲中鬼臼毒素的含量测定技术

孙海峰

黑龙江珍宝岛药业股份有限公司鸡西分公司

目的：建立高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱柱为Diamonsiltm C18柱；流动相：甲醇-0.1mol/L磷酸二氢钾水溶液（50∶50）；流速：1.0ml/min；检测波长：290nm。结果：鬼臼毒素在0.04769～0.4769mg/ml呈良好线性关系（r=0.9996），平均回收率为99.94%，RSD=1.71%（n=5）。结论：采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，操作简便、准确，专属性强。

八角莲；鬼臼毒素；含量测定

八角莲为小檗科植物八角莲Dysosma versipellis（Hance．）M．cheng（Podophyllum versipelle Hance．）的根及根茎。具有清热解毒、化痰散结、祛痰消肿之功能。用于痈肿疔疮、瘰疬、咽喉肿痛、跌打损伤、毒蛇咬伤等。笔者曾对八角莲的性状、显微结构进行过研究［1］。本实验采用高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，为完善八角莲药材的质量标准及临床应用提供科学依据。

1、仪器与试药

1.1 仪器

戴安UltiMateTM3000型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、变色龙（chromeleon）软件数据处理系统；岛津AUW120D分析天平（d＝0．1mg/0．01mg）；UP5200H超声波清洗器（熊猫集团南京 电子 计量有限公司）。

1.2 试药

甲醇为色谱纯（中国上海陆都化学试剂厂）；磷酸二氢钾为分析纯。鬼臼毒素对照品（含量测定用，以93．5%计，批号111645-200301）由中国药品生物制品检定所提供；八角莲Dysosma versipellis（Hance．）M．Cheng（Podophyllum versipelle Hance．），由中南民族大学万定荣教授鉴定和提供。

2、方法与结果

2.1 色谱条件

Diamonsiltm C18色谱柱（250mm×4．6mm，5μm）；流动相为甲醇-0．1mol/L磷酸二氢钾（50∶50）；检测波长290nm；流速1．0ml/ min；柱温30℃；灵敏度：0．1AUFS；理论塔板数按鬼臼毒素峰计算不低于1500。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12h的鬼臼毒素对照品适量，加甲醇制成每毫升约含0．5mg的溶液，摇匀，微孔滤膜过滤（0．45μm），得鬼臼毒素对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

分别取八角莲根茎和根粉末（过3号筛）各约0．5g，精密称取，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，放置12h，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，微孔滤膜过滤（0．45μm），得八角莲根茎和根的供试品溶液。

2.4 八角莲根茎和根HPLC谱图比较

分别取八角莲根茎和根供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪中，对其HPLC图进行比较，比较可以看出，八角莲根中基本不含鬼臼毒素成分。

2.5 线性关系考察

精密称取在五氧化二磷干燥器中减压干燥12h的鬼臼毒素对照品25．5mg，置50ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀（0．51×93．5%＝0．4769mg/ml），精密量取溶液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0ml，分别置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，鬼臼毒素含量为横坐标，绘制标准曲线，统计学计算回归方程为：Y=0．01108X＋8．6782×10-3，r=0．9996。结果表明，鬼臼毒素的进样量在0．04769～0．4769mg/ml的范围内，浓度与峰面积呈良好。

2.6 精密度实验

精密吸取鬼臼毒素对照品溶液10μl，按上述色谱条件，连续进样5次，依次测定各峰的峰面积值，结果鬼臼毒素对照品RSD=0．24%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验

精密吸取密封室温保存的八角莲根茎供试品溶液10μl，分别于0，2，5，8，10h进样，测定其峰面积值，计算RSD=0．84%（n=3），结果表明，供试品溶液在10h内检测对结果无影响，稳定性良好。

2.8 重现性实验

取同一批八角莲根茎样品，按供试品溶液制备方法平行制备5份供试液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，测定5份供试品中鬼臼毒素的含量，结果RSD=1．50%。

2.9 样品测定

取3批八角莲根茎样品，按供试品溶液制备方法操作，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，用外标法测定，计算样品中鬼臼毒素的含量。

2.10 加样回收率实验

取已知含量的八角莲根茎样品5份，各约0．25g，精密称定，分别加入鬼臼毒素对照品2．55mg（2．55×93．5%＝2．3843mg），按供试品溶液制备方法操作，照上述色谱条件测定，计算回收率，结果平均回收率为99．94%，RSD=1．71%。

3、讨论

3.1 八角莲中鬼臼毒素的含量与提取方法有关

八角莲的有效成分为鬼臼毒素，有文献报道八角莲经80%甲醇超声提取，测得鬼臼毒素的含量为0．94%，采用文中所用的甲醇超声提取测得鬼臼毒素的含量为1．01%，结果表明，八角莲中鬼臼毒素的含量可能与提取溶剂、方法等有一定关系，值得进一步研究。

3.2 八角莲根中基本不含鬼臼毒素

通过比较八角莲根与根茎的HPLC图可以看出，八角莲根中基本不含鬼臼毒素，实验结果表明，主要是八角莲的根茎具有鬼臼毒素的抗癌抗病毒活性。

本法测定八角莲中鬼臼毒素的含量，样品预处理简单，有效成分分离良好，而且无其他成分干扰，对八角莲药材的质量控制有一定的参考价值。

[1]陈黎,涂自良,陈吉炎.高效液相色谱法测定八角莲中鬼臼毒素的含量.论文网,2011.08