北京市6岁以下门诊和住院腹泻患儿腺病毒检出率及流行特征

刘立颖 张 又 贾立平 董慧瑾 钱 渊

腹泻是婴幼儿除呼吸道感染外最常见的疾病，而腺病毒(Adenovirus，Ad)则是除轮状病毒和诺如病毒外儿童腹泻最重要的病原［1］。由于Ad感染目前尚无特效的治疗药物和疫苗，因此对其进行有效地防控，全面了解其在腹泻儿童中的感染状况显得尤为重要。国内外有关Ad检出率的差别较大，巴西［2］、法国［3］和澳大利亚［4］的腹泻患儿中 Ad的检出率分别为3.6%，5%和6%，而在一项对亚洲3国(越南、日本、韩国)腹泻患儿Ad的研究中［5］，越南儿童Ad的检出率仅为2.8%，韩国儿童则达到了8.7%，日本儿童为5%。我国也有多个地区报道了腹泻患儿Ad的感染情况，检出率为3.7%～17.6%［6，7］，造成这种差异的原因可能是多方面的。有文献推测［8］与地理位置、检测时间、气候条件、不同人群遗传和免疫背景的差别有关，也可能与Ad检测的方法、检测Ad型别的完整性、样本的来源(门诊或住院)有关。本研究拟对首都儿科研究所(我院)门诊和住院腹泻患儿的粪便标本，以PCR的方法检测肠道Ad(EAd)和非肠道Ad(NEAd)，进一步丰富腹泻患儿Ad检出率临床信息。

1 方法

1.1 急性腹泻的诊断标准24h大便次数增加至≥3次或大便次数超过正常排便次数且大便性状明显改变，包括稀水样、黏液样或稀糊样便等，无脓血。

1.2 病例来源 ①2011年1月至2012年12月在我院门诊诊断为急性腹泻的患儿;②2010年1月至2013年12月在我院因急性腹泻住院或住院期间出现腹泻症状并诊断为急性腹泻的患儿;③年龄0～6岁。

1.3 粪便标本 门诊急性腹泻患儿粪便标本采集时间为就诊当天;因急性腹泻住院患儿的粪便标本采集时间为住院当天;住院期间出现腹泻症状的患儿于出现腹泻症状当天采集粪便标本。本研究用于检测Ad的粪便标本为临床粪便常规和轮状病毒检测后剩余的粪便标本，在排除了粪便常规检测显微镜高倍视野下WBC＞5个和有RBC者后，于-20℃保存备用。每例送检粪便标本记录性别、年龄和送检日期，住院患儿记录住院号和病区。

1.4 Ad分型 人类Ad已发现56个血清型并根据血凝特性分归为A至G组［9］。A组包括Ad12、18和31;B组包括Ad3、7、11、14、16、21、34、35、50 和 5 5;C 组包括 Ad1、2、5 和6;D 组 包括 Ad8～10、13、15、17、19、20、22～30、32、33、36～39、42～49、51、53、54 和 5 6;E 组包括 Ad4;F 组包括 Ad40和41;G组包括Ad52。其中F组Ad是引起腹泻最主要的类型，又被称为 E Ad［10］;余则为 N EAd，也可以引起腹泻症状。

1.5 Ad检测

1.5.1 DNA提取 参照本实验室前期建立的改良粪便DNA 提 取法［11］，使用 D NAzol试剂(MRC 公司，美国)提取粪便标本DNA。

1.5.2 Ad检测 使用针对Ad所有型别的通用引物［12，13］检测粪便标本，对通用引物检测阳性的粪便标本用特异性引物［14］进一步进行EAd鉴定，引物见表1，反应条件见文献［11］。PCR产物进行2%琼脂糖凝胶(含0.5%μg·mL-1溴化乙锭)电泳，60 V，25 min。为降低吞入呼吸道分泌物Ad检出的概率，对PCR阳性产物进行复核(加入模板量的1/2)，2次结果均为中等强度以上条带的标本判定为阳性，由英潍捷基(上海)贸易有限公司对所有PCR阳性产物进行测序，并在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)上进行分型验证。

1.5.3 轮状病毒检测 采用轮状病毒抗原检测试剂盒(Microgen Bioproducts Ltd，UK)对Ad检测阳性的粪便标本进行轮状病毒抗原检测。

表1 Ad鉴定引物Tab 1 Primers for Ad identification

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以百分比表示，率的显著性采用χ2检验。对Ad感染的流行特征采用按年龄分析的方法［8，15］，分为新生儿、～6月龄、～1岁、～2岁和～6岁。(P＜0.05)为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 进入本文分析腹泻患儿3 357例。其中门诊腹泻患儿862例，男556例(64.5%)，女306例，新生儿2例(0.2%)，～6月龄253例(29.4%)，～1岁310例(36.0%)，～2岁224例(26.0%)，～6岁73例(8.5%)。住院腹泻患儿2 495例，男1 547例(62.0%)，女948例，其中因急性腹泻住院的患儿367例(14.7%)，住院期间出现腹泻的患儿2 128例;新生儿252例(10.1%)，～6月龄

826例(33.1%)，～1岁 4 48例(18.0%)，～2岁 6 41例(25.7%)，～6岁328例(13.1%)。

2.2 Ad检出情况及型别分布3 357例腹泻患儿粪便标本中Ad检测阳性341例(10.2%)。门诊腹泻患儿Ad阳性70/862例(8.1%)，分属A、C和F组。图1A显示，EAd 40例(57.1%)，包括 Ad41和 40型别;NEAd 30例(42.9%)，包括Ad31和2等5种型别。住院腹泻患儿Ad阳性271/2 128例(10.9%)，分属A、B、C、E和F组。图1B显示，EAd 114例(42.1%)，包括 Ad41和40型别;NEAd 157例(58.9%)，包括Ad31和7等11种型别。门诊和住院腹泻患儿中，Ad和NEAd检出率差异均有统计学意义(χ2分别为 3 53.9 和 9 .63，P 分别为 0 .022 和 0 .002)，而EAd检出率差异无统计学意义(χ2=0.007，P=0.931)。

2.3 Ad阳性病例的性别分布 门诊腹泻男女患儿Ad的检出率分别为9.0%(50/556)和6.5%(20/306)，差异无统计学意义(χ2=1.597，P=0.206)。住院腹泻男女患儿Ad检出率分别为11.7%(181/1 547)和9.5%(90/948)，差异无统计学意义(χ2=2.956，P=0.086)。住院和门诊男女患儿Ad检出率差异均无统计学意义(χ2分别为3.066和2.539，P分别为0.080和0.112)。

2.4 Ad阳性病例的年龄分布 门诊腹泻患儿Ad检出率:～6月龄为4.3%(11/253)，其中EAd 5例，NEAd 6例;～1岁为7.7%(24/310)，其中EAd 10例，NEAd 14例;～2岁为11.6%(26/224)，其中 E Ad 18例，NEAd 8例;～6岁为12.3%(9/73)，其中EAd 7例，NEAd 2例。～2岁和～6岁以EAd感染为主。各年龄段Ad检出率差异有统计学意义(χ2=10.246，P=0.017)。

住院腹泻患儿Ad检出率，新生儿为4.4%(11/252)，其中EAd 9例，NEAd 2例;～6月龄为9.4%(78/826)，其中EAd 31例，NEAd 47例;～1岁为13.2%(59/448)，其中EAd 17例，NEAd 42例;～2岁为12.3%(79/641)，其中EAd 41例，NEAd 38例;～6岁为13.4%(44/328)，其中

EAd 16例，NEAd 28例。除新生儿和～2岁外，其他各年龄段均以NEAd感染为主。各年龄段Ad检出率差异有统计学意义(χ2=18.791，P=0.001)，两两比较，～6月龄与～1岁患儿Ad检出率差异有统计学意义(χ2=4.203，P=0.04)，其他各年龄段两两比较Ad检出率差异均无统计学意义。

2.5 Ad全年感染的时间分布 表2显示，无论是门诊亦或住院腹泻患儿，全年各月均可见Ad检出。门诊腹泻患儿 Ad检出率在1、4、6、8 和12 月较低(3.7%～4.6%)，在3、5和10月较高(12.0%～12.7%)。住院腹泻患儿Ad检出率4月最低(5.8%)，5月(16.2%)和6月(16.5%)最高。

2.6 合并轮状病毒感染情况 门诊和住院腹泻患儿Ad合并轮状病毒感染10.8%(37/341)，其中门诊腹泻患儿Ad合并轮状病毒感染11.4%(8/70)，住院腹泻患儿Ad合并轮状病毒感染10.7%(29/271)，与门诊腹泻患儿差异无统计学意义(χ2=0.030，P=0.862)。合并轮状病毒感染男女性分别为12.1%(28/231)和8.2%(9/110)，差异无统计学意义(χ2=1.195，P=0.274)。仅住院腹泻患儿新生儿Ad阳性病例未合并有轮状病毒感染，其他年龄段均合并有轮状病毒感染。

表2 门诊和住院腹泻患儿全年Ad感染分布［n/N(%)］Tab 2 Monthlydistribution for Addetection rate in outpatient andhospitalizeddiarrheal children［n/N(%)］

3 讨论

本研究进入分析的病例不仅仅是单纯腹泻的患儿，还包括因其他疾病入院但也出现了腹泻症状的住院患儿，粪便标本中检测到的Ad尤其是NEAd有可能来自其他非肠道系统感染。

本研究Ad的总检出率为10.2%，高于国内外大多数相关的文献报道［2，4～6，8，16～21］，低于本研究团队前期北京地区住院腹泻患儿 Ad检出率(14.6%)，也低于日本(12.5%)［22］、英国(15.0%)［23］、德国(14.0%)［24］和中国天津(17.62%)［7］腹泻患儿Ad检出率。造成Ad检出率差异的因素非常复杂，有研究推测，标本来源于单纯腹泻就诊的门诊患儿、单纯腹泻住院的患儿、社区的腹泻患儿和住院期间出现腹泻症状的患儿所得出的Ad检出率可能存在差异，本研究单纯腹泻就诊的门诊患儿Ad检出率(8.1%)和住院腹泻患儿Ad检出率(10.9%)，差异有统计学意义，本文住院腹泻病例有以急性腹泻入院的病例，也有入院期间出现腹泻症状的病例，这部分病例未能区分社区还是医院获得性腹泻;本研究团队前期以有腹泻症状住院患儿Ad检出率的研究表明，社区获得性Ad检出率(14.9%)和院内获得性Ad检出率(14.3%)差异无统计学意义，说明导致Ad检出率差异还是与标本来源单纯性有关。目前常见的检测Ad的方法包括电镜观察法、EIA方法(包括ELISA法，胶体金抗原检测等)和PCR方法。电镜观察方法虽然直观准确，但由于设备技术所限，应用有限;EIA方法操作方便，有文献报道PCR方法比 EIA方法Ad检出率高10%［21］，采用EIA方法检测Ad会影响整体Ad的检出率。尽管近些年来更多的研究采用PCR方法检测Ad，但检出率与是否为通用引物扩增Ad全部型别有关，本研究NEAd的检出率在住院腹泻患儿为6.3%(157/2 495)、门诊腹泻患儿为3.5%(30/862)，如果检测NEAd型别不完整也会降低Ad的检出率。多个数据显示低纬度热带亚热带地区Ad检出率相对偏低，如越南(2.8%)［5］，中国深圳(1.8%)［19］、成都(2.0%)［18］、南京(2.9%)［20］，相比较而言高纬度地区如日本(8%)［17］、法国(12%)［3］、德国(14.0%)［24］、中国天津(17.6%)［7］、北京地区(10.2%～14.6%)Ad检出率更高。

多项腹泻患儿病毒感染状况的研究表明:腹泻患儿中各种病毒(主要包括轮状病毒、腺病毒、杯状病毒、星状病毒)共感染率并不高，如1项法国研究［3］，4种病毒混合感染率为9.5%，而来自希腊［21］的报道为4.4%，中国长春为7.2%［25］;也有研究表明，Ad阳性患者杯状病毒的共感染率为8%，星状病毒的共感染率仅为2%［23］;来自中国深圳的研究显示杯状病毒共感染率为15%，未见星状病毒共感染［19］。本文Ad阳性腹泻患儿合并轮状病毒的感染率为10.8%，有接近90%的患儿在本研究中被测定为Ad感染，虽然本研究未检测其他肠道病毒如杯状病毒和星状病毒，但仍说明Ad同儿童腹泻密切相关，是儿童腹泻重要致病原。

本文住院腹泻患儿Ad检出率(10.9%)高于门诊腹泻患儿(8.1%)，差异有统计学意义，与因疾病住院导致Ad感染机会增加有关。这一结果与本研究团队前期研究医院获得性Ad腹泻(14.3%)略低于社区获得性 Ad腹泻(14.9%)结果不同，后者界定了住院后48h后才出现腹泻症状为医院获得性腹泻，而本文住院患儿中不仅包括了367例(14.7%)以急性腹泻入院的患儿，也没有对住院期间发生腹泻进行时间上的定义。本文门诊Ad阳性病例以EAd(57.1%)为主，住院Ad阳性病例以NEAd(57.9%)为主，儿童医院中感染仍然是主要的住院原因，可能增加了NEAd感染机会。

EAd中，Ad41是本研究中检出最多的Ad型别，分别占门诊和住院Ad阳性病例的45.7%和39.5%，是门诊和住院Ad阳性病例主要型别，Ad40是门诊Ad阳性病例次要型别(11.4%)，但Ad40在住院Ad阳性病例仅为2.6%。NEAd分别占门诊和住院Ad阳性病例的42.9%和57.9%，与一项来自南京［20］的报道具有相似的结果，但远高于其他研究中的比例［5，8，24］。巴西的研究［2］显示 NEAd 涵括了A～E组，本研究未检测到D组Ad。NEAd中，住院腹泻患儿主要检出Ad31和7，而门诊腹泻患儿中常见的是Ad31和2，具有较为明显的型别优势。一项包括了越南、韩国和日本腹泻患儿研究，检出的NEAd包括:Ad3、5、8和31，来自于澳大利亚［4］和中国兰州［8］、长春［25］、深圳［20］的 Ad 检测人群，检出的 NEAd 包括 Ad1、2、6、7、12 和 57 ，NEAd 的检出率没有表现出明显的型别优势。本研究NEAd检出数量多、型别丰富，而且型别优势明显，一方面与使用高度敏感的PCR方法有关，所设计的通用引物可以扩增Ad所有型别有关，另一方面与检测的样本量大、样本来源的多样性有关(以单纯腹泻就诊的门诊患儿、以单纯腹泻住院的患儿，住院期间发生腹泻的患儿)。值得注意的是，无论是在门诊亦或住院患儿Ad31是仅次于Ad41的优势型别的NEAd，本研究同一实验室的呼吸道Ad长期监测未检测到Ad31［26］，提示Ad31可能主要作用于胃肠道，并导致儿童腹泻。

本研究住院腹泻新生儿Ad检出率远低于其他年龄组，与轮状病毒检出率没有年龄差异［27，28］不同。6个月后各年龄组Ad的检出基本没有差异，推测母传抗体在婴幼儿(6个月内)避免Ad性腹泻，尤其是对NEAd引起的腹泻中起到重要的作用。无论在门诊腹泻患儿或住院腹泻患儿中，Ad的检出在全年各月均可见到，没有数据支持其感染存在季节流行差异。来自中国兰州［8］、巴西［2］和澳大利亚［4］的研究也表明腹泻儿童Ad感染并没有一致的流行规律。

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