苯并异噻唑啉酮甲酸酯类衍生物的海洋防污性能研究

魏 婕，王旭裕，王向辉，林 强，王爱民，杨建新

(1.海南大学热带生物资源教育部重点实验室;海南省精细化工工程技术研究中心;海南大学材料与化工学院，海南海口570228;2.海南师范大学化学与化工学院，海南海口571158)

近年来，生物污损问题已严重制约了海洋资源与能源的开发利用.海洋污损生物也称海洋附着生物，是生长在船底和海洋固定设施表面的动物、植物和微生物［1］.海洋污损会堵塞水下管道;损坏仪器设备;加速金属表面腐蚀.被污损生物大量附着的船舶往往自重增加、船体底面粗糙度增大、航速降低、油耗增加，迫使船舶频繁整修，故防污问题受到了人们的极大关注［2－4］.

在众多防污方法中，涂覆防污涂料是最为经济、便捷的方法.其主要作用机理是通过漆膜中防污剂的逐步渗出，抑制海洋污损生物附着生长，以达到防止海洋生物污损的目的.早期传统防污涂料以Cu2O为主要成份，其毒剂大量富集在生物体内，并通过食物链进入人体，进而对人类健康造成威胁.20世纪70年代开发的有机锡防污涂料具有较强的毒性，即使百亿分之几的浓度也足以造成海洋生物的畸形，因此，该涂料在2008年被全面禁用.为此，异噻唑啉酮类衍生物被作为杀菌剂而应用于许多行业，尤其是作为绿色防污剂而得到了广泛认可［5－6］.此类化合物具有抑菌能力强、应用计量小、普适、低毒等优点，它对于促进海洋资源与能源的开发利用以及保护海洋的生态环境具重大的意义.

由于藤壶具有较强的繁殖能力和广泛的分布，因此它已成为最主要的海洋污损生物之一.目前，许多国内外学者把藤壶作为防治海洋生物污损的重要研究对象［7－8］.Sasikumar等人对多种海洋常见的污损动物进行了测试，分析了它们对石油、重金属、碳水化合物、清洁剂及多种有机化合物的敏感性，通过比较认为藤壶幼虫最适宜作为防污实验的材料［9］.

在此前工作中，笔者设计合成了一系列苯并异噻唑啉酮类衍生物，并测试了这些化合物对细菌及真菌的抑制活性［10－13］.结果表明，合成的化合物对于细菌及真菌均有优良的抑制活性，具有进一步开发成为新型环保防污涂料的潜力.因此，本文在此前工作的基础上，选取藤壶二期无节幼虫为实验对象，研究了2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物对藤壶的毒性效应，并结合浅海挂板实验，考察了其防污性能.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂 体视显微镜:北京泰克仪器有限公司;LED光源;培养皿;瓷砖(300 mm×150 mm×3 mm);网纹藤壶Ⅱ期无节幼虫;新取海水;二甲基亚砜(分析纯);B04－10白哑光丙烯酸磁漆(广西北海市造漆厂);天那水(海口市博爱化工厂).

1.2 合成实验 2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物是由固体三光气、脂肪醇和苯并异噻唑啉酮(BIT)为原料而合成［14］，具体合成路线如下:

图1 目标化合物合成路线

1.3 藤壶的生物活性实验

1.3.1 成体藤壶的采集与幼虫的繁殖 新取的海水经过滤、高压灭菌备用.藤壶采自废弃木船底部，并选择个体较大的藤壶成体以便繁殖幼虫.将采集好的藤壶清洗干净，刷去表面淤泥和其他海洋生物，放入装有新鲜海水的烧杯中，阳光照射刺激1 h后，可获得大量藤壶一期和二期的无节幼虫，培养3 h后，即可得到藤壶的二期无节幼体.根据藤壶幼虫的趋光性，以LED灯作为光源，用滴管小心吸取趋光性良好的藤壶幼虫，肉眼观察，确定幼虫个数，将其转移到盛有新鲜海水的小烧杯中，控制其密度不超过5只/mL，供实验用.

1.3.2 藤壶幼虫急性毒性实验 准确称取2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物10 mg，溶于10 mL DMSO中，用过滤灭菌后的新鲜海水稀释，分别配制成质量浓度为5、4、3、2、1 mg/L的受试溶液，并设BIT、含等量浓度的DMSO溶液和海水作为对照组.每个化合物共8组实验，每组均设3个平行样.用滴管小心吸取藤壶幼虫，用与各组实验浓度相同的毒液润洗后再放入培养皿中，确保实验组药物浓度的准确性.每个培养皿中藤壶二期无节幼虫数为30只，分别在投入幼虫12 h、24 h后用体视显微镜观察，并记录死亡幼虫个数.实验期间，避光加盖、不投饵、不通气.

实验以国内外广泛使用的“停止游动”现象作为判断藤壶幼虫死亡的标准.观察时，轻摇培养皿，如果沉到培养皿底部的藤壶幼虫停止游动和附肢停止振动(15秒以上)，则认为已经死亡，记录后将确认死亡的幼虫吸出［15］.

1.4 浅海挂板实验 参照国家标准“浅海挂板试验标准”(GB/T 5370—2007)进行海洋挂板实验，对所制备的防污涂料的防污性能进行了考察［16］.

选取2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物a、c、e、f进行浅海挂板实验.根据油漆固含量将化合物配制成质量浓度为0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料，并以BIT及空白样板做对照组.实验样板采用瓷砖(300 mm×150 mm×3 mm)，以避免海水对材料表面腐蚀，从而消除了腐蚀干扰.用天那水做溶剂，以丙烯酸磁漆为成膜剂，配制不同质量浓度的防污涂料.瓷砖表面洗净后，涂刷两道自制防污涂料，室温晾干至固化完全.实验地点为海南省海口市世纪大桥北端浅海，沿岸礁石附着有大量藻类、石灰虫、网纹藤壶、牡蛎等污损生物.将实验样板做好显著标识，固定于框架中，样板浸海深度为1 m.

实验板浸入浅海后，需定期检查、记录和拍照.观察前小心清洗样板，除去板上淤泥，并注意不得损坏防污漆膜;观察后尽快将样板放回原处，避免已附着生物死亡而影响实验结果.最后，根据样板表面的附着生物种类及数量评价防污性能.

2 结果与讨论

2.1 藤壶幼虫急性毒性实验结果与分析 根据实验所得的数据，分析各化合物对藤壶幼虫的急性毒性效应.以受试化合物浓度为横坐标，并以12 h以及24 h藤壶幼虫的死亡率为纵坐标，分别作图:

图2 化合物对藤壶幼虫的毒性效应（12 h）

图3 化合物对藤壶幼虫的毒性效应（24 h）

从上图可以看出，当质量浓度达到5 mg/L时，各化合物对藤壶幼虫均有一定的毒性作用，且毒杀效果均优于对照组BIT.从图2(12 h)可看出，化合物c的质量浓度为1 mg/L时，藤壶的死亡率仅为1.1%，但质量浓度为4 mg/L时，其死亡率已达100%，也就是说，在1～4 mg/L之间，化合物c对藤壶的毒性效应急速增加.与之相比，24 h(图3)时，当化合物e的质量浓度为1 mg/L，藤壶幼虫的死亡率已超过75%，可见，化合物e质量浓度在0～1 mg/L之间时，藤壶幼虫对其极为敏感，微量毒剂就已有明显毒杀效果.此后，随着质量浓度的继续增加，死亡率缓慢上升.由此可以得出，藤壶幼虫对不同化合物质量浓度区间的敏感性存在差异，毒性效应随化合物质量浓度的增加呈两种不同趋势:毒性快速增强趋势和毒性缓慢增加趋势.就所有化合物而言，无论是12 h，还是24 h，随化合物质量浓度的增加，藤壶幼虫的死亡率均升高，各化合物对藤壶幼虫的毒性效应增强.在相同实验条件下，12 h的有效致死率均小于24 h的有效致死率，说明随时间的推移，各化合物对藤壶的毒性作用不断增强.

采用概率单位法计算藤壶二期无节幼虫的半致死浓度(LC50)，将浓度换算成对数值，各浓度对应的死亡发生频率换算成概率单位，通过化合物质量浓度对数和死亡概率单位的线性回归，做回归直线.当概率单位为5时，所对应的值即为LC50的对数，查询反对数表，得各化合物对藤壶二期无节幼虫的半致死浓度(LC50)［17］，数值见下表:

从表1可看出，所设计合成的6个苯并异噻唑啉酮类衍生物对藤壶幼虫均有一定的毒性作用，且毒杀效果优于BIT.随时间推移，毒性作用增加，24 h藤壶幼虫LC50仅为12 h的一半左右.根据上表LC50数值可看出，随化合物取代基中碳原子数目的增加，LC50逐渐减小，即杀死50%的藤壶幼虫所需的化合物质量浓度逐渐降低.推测:受试化合物对藤壶的毒性作用与其结构存在一定的关系，碳原子数目增加，有利于毒性作用的增强.

表1 9种有机化合物对网纹藤壶Ⅱ期无节幼虫的LC50

2.2 浅海挂板实验结果与分析 基于以上实验结果，选取LC50值有明显差异的a、c、e、f 4个化合物进行浅海挂板实验.以BIT以及空白样板作为对照，根据油漆固含量配制质量浓度为0.01%、0.05%和0.1%的防污涂料.海洋挂板实验90 d后，取出实验板拍照，结果如图4所示:

图4 浸海实验样板照片

化合物a具有良好的防污性能，其质量浓度为0.01%(图a－1)时，有少量藤壶附着.增加质量浓度到0.05%(图a－2)时，仅有少量藻类沉积.当质量浓度达0.1%(图a－3)时，板面光滑，未见任何污损生物附着.化合物c也具有优良的防污效果，浸海90 d后，实验板表面少有污损生物附着，且防污性能随其质量浓度的增加而增强.化合物e对海洋污损生物的抑制作用较好，其质量浓度为0.01%时(图e－1)，有少量污损生物附着生长，当其质量浓度达0.1%(图e－3)时，未发现污损生物，防污效果可达要求.化合物f的质量浓度低于0.05%(图f－1、f－2)时，有较多藤壶附着，当增大质量浓度至0.1%(图f－3)时，对污损生物有较好的抑制作用.对照组空白样板(KB)以及化合物BIT样板经过90 d的海水浸泡后，表面均出现了藤壶、牡蛎、石灰虫等大量污损生物附着.

浅海挂板实验表明:合成化合物取代基不同，对污损生物的抑制作用也不同，且防污性能随化合物质量浓度的增加而提高，当质量浓度为0.1%时，少有污损生物附着，其90 d的防污效果基本可达要求.各化合物防污效果明显优于空白样板及同浓度下的BIT样板，因此，2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物比BIT具有更优良的防污性能，以上结论与藤壶急性毒性的实验结果相符.

3 结论

本文研究了6个2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物对藤壶二期无节幼虫的急性毒性效应，并选取其中毒杀效果较好的4个化合物进行浅海挂板实验.

藤壶毒性实验表明:各化合物对藤壶幼虫均具有一定的毒性作用，且毒杀效果随化合物质量浓度的增加及作用时间的延长而提高.藤壶幼虫对不同化合物质量浓度区间的敏感性存在差异.毒性效应随化合物质量浓度的增加呈毒性快速增强的趋势或毒性缓慢增加的趋势.LC50数据表明，随化合物取代基中碳原子数目的增加，LC50逐渐减小，毒性作用逐渐增强.

浅海挂板实验表明:化合物的不同取代基对污损生物的抑制效果存在差异，其防污性能随化合物质量浓度的增加而提高，质量浓度为0.1% 时，防污效果基本可达要求，与藤壶毒性实验结果相一致，2－(苯并异噻唑啉－3－酮－2－基)甲酸酯类化合物比BIT具有更优良的防污性能，有进一步开发成为新型海洋防污涂料的潜力.

致谢

感谢海南省精细化工工程中心，海南大学分析测试中心，海南大学海洋学院对本文的支持.

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