神经生长因子在溃疡性结肠炎中的表达和意义

李 倩 许翠萍 杨 梅 孙园园

山西医科大学(030001)

神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是目前研究最为广泛的神经细胞生长调节因子，是一类对神经元发育、存活、凋亡起重要作用的蛋白质。NGF在机体组织损伤和炎性反应中可调控免疫细胞活性，参与炎性反应，发挥促炎或抗炎效应。近年来，多项研究表明炎症性肠病(IBD)患者肠道神经系统(ENS)结构和功能表现异常，提示ENS也参与了IBD发病过程[1]。NGF是ENS中重要的神经递质，国外多项研究[2-3]表明，NGF及其受体在溃疡性结肠炎(UC)肠黏膜组织中表达上调，但对NGF在UC患者血清中的表达少见报道。本研究通过检测NGF在UC患者肠黏膜和血清中的表达，旨在探讨NGF在UC发病机制中的作用及其意义。

材料与方法

一、标本获取

纳入2011年1月-2013年5月山西医科大学第一医院消化科确诊的UC患者40例，其中男21例，平均年龄(50.24±14.01)岁，女19例，平均年龄(42.63±14.36)岁；UC呈轻度13例、中度19例、重度8例；累及直肠10例、直肠乙状结肠14例、全结肠16例。UC诊断标准参照“对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见(2007年，济南)”[4]。选取同时期单纯性结肠息肉患者10例作为对照组。所有患者行结肠镜检查，在病变处和距息肉5 cm以上正常肠道黏膜处取样。对20例UC患者和10例同期健康体检者采集静脉血2 mL，静置30 min，3 000×g离心10 min分离血清，于-80 ℃冰箱保存待测。

二、方法

肠黏膜标本行免疫组化染色检测NGF，PBS为一抗阴性对照，切片经常规脱蜡、5% H2O2阻断内源性过氧化物酶；枸橼酸(pH 6.0)高温(120 ℃)高压热修复2 min；4 ℃过夜；二抗为辣根过氧化物酶，37 ℃孵育30 min；DAB显色，苏木精复染，树胶封片。血标本以ELISA法检测NGF，检测步骤严格按试剂盒说明书进行。

免疫组化染色结果判断：随机观察5～10个高倍镜视野，阳性细胞数<25%为(+)，25%～49%为(++)，≥50%为(+++)。采用积分综合计量，计算公式为(+)%×1+(++)%×2+(+++)%×3，总数值<1.0为(+)，1.0～1.5为(++)，>1.5为(+++)，每张切片至少随机观察5～10个高倍视野，使用Image-J软件测量灰度值，取其平均值，比较阳性表达强度，灰度值越小，阳性表达越强。

三、统计学分析

结 果

一、两组肠黏膜组织中的NGF表达

UC组肠黏膜组织中NGF阳性表达较多，NGF主要表达于黏膜上皮、腺体上皮以及炎性细胞的胞质中，而对照组肠黏膜组织中NGF阳性表达较UC组明显减少(188.71±5.92对167.04±12.22)，差异有统计学意义(P<0.01)。

二、轻、中、重度UC患者肠黏膜组织中NGF的表达

轻度(176.94±11.28)与中度(162.27±10.57)和重度(162.26±7.45)UC患者肠黏膜组织NGF表达差异有统计学意义(P<0.05)，但中度与重度间差异无统计学意义(P>0.05)(图1)。NGF表达与UC严重程度呈正相关(rs=0.505,P<0.05)。

A：对照组；B：轻度UC；C：中度UC；D：重度UC

三、不同病变部位肠黏膜组织NGF的表达

UC患者中，病变位于直肠、直肠乙状结肠、全结肠的肠黏膜组织中NGF的表达差异无统计学意义(P>0.05)(表1)，提示NGF表达与病变部位无关。

表1 UC组不同病变部位间肠黏膜组织NGF的表达

四、两组血清NGF表达

UC组血清NGF表达较对照组升高[(23.24±14.20) pg/mL对(17.47±2.47) pg/mL]，但差异无统计学意义(P>0.05)。20例UC患者肠黏膜组织和血清中NGF表达呈负相关(r=-0.529,P<0.05)。

讨 论

对UC发病机制的研究一直是国内外学者研究的热点，而重点主要集中在免疫异常、感染、环境以及精神因素等方面。Johansson等[3，5]通过对接受外科手术的UC患者肠道标本进行研究发现，NGF在肠道神经组织和非神经组织中均有表达，主要存在于黏膜上皮、腺体上皮以及炎性细胞胞质中，且黏膜层炎性细胞浸润越多，NGF表达越强，说明NGF与炎性反应有关。现已知肿瘤坏死因子-α(TNF-α)参与了UC的发病过程。对转基因小鼠的关节炎模型研究[2]显示，NGF可以通过增加前列腺素E2(PGE2)的合成和分泌下调TNF-α。亦有文献报道，NGF可活化肥大细胞(Mc)，并诱导Mc合成、分泌NGF，NGF既可通过自分泌方式作用于Mc，又可通过旁分泌方式促进神经元和轴突再生，而神经再生可能成为UC黏膜愈合的关键因素[3]。因此，NGF可能在UC组患者病情转归中发挥以抗炎为主的综合性保护作用。另外，小鼠结肠炎模型显示，抗-NGF治疗可加重肠道炎症的严重程度[6]。本研究中，NGF在UC肠黏膜组织中的表达较正常组明显增高，而且中、重度UC患者肠黏膜NGF表达高于轻度患者，可见炎症程度越重，NGF表达也越强。NGF在UC肠道黏膜组织中表达增高可能与UC的发病机制有关，且与UC疾病程度呈正相关，中、重度UC中NGF表达明显增多可能是一种保护作用，但本研究发现UC中NGF的保护作用与病变部位无关，这是由于UC时ENS的结构和功能改变无部位特异性。何荣国等[7]的研究发现，慢性荨麻疹患者血清NGF水平明显高于正常对照人群，并与焦虑/抑郁的评分呈正相关，说明慢性荨麻疹患者的情绪对内源性NGF的表达有一定程度的影响。很多学者认为，UC是一种身心疾病，某些心理精神因素，如紧张、焦虑、抑郁等可诱发或加重病情，UC患者如果处于焦虑/抑郁中，可能导致自主神经功能紊乱，引起内源性NGF水平升高，血清NGF水平可能成为反映UC病情活动的有效指标之一。本研究中，NGF在UC患者血清中的表达与其在肠黏膜组织中的表达呈负相关，测定其血清水平也许有助于疾病程度的判断。此外，NGF在UC组血清中的表达浓度较对照组高，但差异无统计学意义，可能与样本量小有关。

综上所述，NGF在UC中表达增高可能与UC的发生、发展密切相关，也进一步说明神经-免疫-内分泌在UC发病中的作用，但神经系统在UC中的具体发病机制尚不清楚，其在UC中究竟发挥怎样的作用有待继续研究。将外源性NGF用于UC的实验研究，可能有助于为UC的治疗提供新思路。

1 张德奎，甘华田. 重视研究肠道神经系统在炎症性肠病发病中作用[J]. 世界华人消化杂志, 2008, 16 (28): 3200-3203.

2 Johansson M, Norrgård O, Forsgren S. Are neurotrophins important in ulcerative colitis?[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1107: 290-299.

3 Johansson M, Norrgård O, Forsgren S. Study of expression patterns and levels of neurotrophins and neurotrophin receptors in ulcerative colitis[J]. Inflamm Bowel Dis, 2007, 13 (4): 398-409.

4 欧阳钦，胡品津，钱家鸣，等. 对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见(2007年，济南)[J]. 中华消化杂志, 2007, 27 (8): 545-550.

5 Johansson M, Jönsson M, Norrgård O, et al. New aspects concerning ulcerative colitis and colonic carcinoma: analysis of levels of neuropeptides, neurotrophins, and TNFalpha/TNF receptor in plasma and mucosa in parallel with histological evaluation of the intestine[J]. Inflamm Bowel Dis, 2008, 10 (14): 1331-1340.

6 Reinshagen M, Rohm H, Steinkamp M, et al. Protective role of neurotrophins in experimental in inflammation of the rat gut[J].Gastroenterology, 2000, 119 (2): 368-376.

7 何荣国，田华，张锡宝，等. 慢性荨麻疹患者负性情绪与血清神经生长因子水平的相关性研究[J]. 中国麻风皮肤病杂志, 2007, 23 (9): 783-784.