维生素C对静脉铁剂诱导的外周血单个核细胞凋亡的干预作用

张红强，李丹妮，陈 建

(重庆第三军医大学附属新桥医院 肾内科 血液净化中心，重庆，400037)

铁缺乏在慢性肾脏病患者，特别是接受维持性血液透析(MHD)的患者中很常见，是导致肾性贫血的重要原因之一。而肾性贫血是促进慢性肾衰竭进展、增加心脑血管并发症的发生率及病死率的重要危险因素[1]。静脉铁剂和口服铁剂都能改善这种铁缺乏状态，且前者疗效更显著，副作用小，临床用药相对方便，所以静脉铁剂的临床应用更为广泛[2-3]。但是二者都会加重MHD患者体内的氧化应激状态，进而加剧微炎症状态[4]、感染、心血管并发症[5]等的发生。已有临床报道[6]称口服或静脉补充维C[7]都可以减轻补铁剂诱导的MHD患者氧化应激状态。

HPBMC即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，发挥细胞免疫功能。HPBMC易被细胞因子和线粒体氧化损伤激活，进而ROS生成量增多并发生凋亡，这是造成MHD患者外周血免疫细胞数量减少，免疫功能缺陷的重要原因之一[8]。在进行MHD治疗时常用静脉铁剂来纠正患者铁缺乏，增加铁储备，研究发现这同时也发现其会加重MHD患者体内的氧化应激状态[9]。这是否跟静脉铁剂对MHD患者外周血单核细胞(HPBMC)氧化应激加剧和细胞凋亡的影响有关尚不清楚，因此本研究使用静脉铁剂处理体外培养的MHD患者HPBMC，并使用维C进行干预，探索静脉铁剂对HPBMC的氧化应激和细胞凋亡的影响以及维C对此的干预作用。

1 资料与方法

1.1 主要仪器与试剂

流式细胞仪(BD FACS ARIA，美国)，Western blot成像仪(Carestream Health，美国)，多功能酶标仪(Beckman Coulter，美国)，4种静脉铁剂(西南药业，重庆)，维生素C注射液(双鹤药业，北京)，单个核细胞分离液(灏洋生物科技，天津)，RPMI 1 640培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(Hyclone，美国)，Bax、Bcl-2一抗(Santa Cruz，美国)，HRP标记山羊抗兔二抗、Caspase-3的活性检测试剂盒(碧云天，江苏海门)，ROS Fluorescent Probe-DHE(Sigma，美国)，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(三箭生物科技，天津)。

1.2 HPBMC的分离与培养

取10 mL肝素钠抗凝外周静脉血按血：分离液按1∶2的比例缓慢注入人淋巴细胞分离液上层，400 g 20 ℃离心30 min，取白膜层细胞重悬于4倍体积的RPMI 1 640中，200 g，10 min离心洗细胞，重复2次。按1×106个/mL的浓度将细胞接种于含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1 640培养基中，加入植物血凝素(PHA)至终浓度300 μg/mL。

1.3 试验分组与处理

按照上述方法培养24 h，然后更换为不含PHA的1 640培养液，分为对照组，Is处理组，Id处理组，Fg处理组，Fc处理组，Id+维C干预组。4种静脉铁剂的浓度均为200 μg/mL，维C的终浓度为25 μmol/L。对照组给予1640培养基，Is、Id、Fg、Fc处理组分别给予含对应静脉铁剂的1 640培养基，培养8 h; Id+维C干预组先给予含Id的1640培养基培养2 h，再加入维C继续培养至6 h。收集细胞进行后续实验。

1.4 细胞凋亡率的检测

使用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率：收集细胞用孵育缓冲液洗涤1次，800 r/min离心5 min。用100 μL孵育缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC标记的抗Annexin V抗体，室温下避光孵育10 min后加入5 μL PI染色5 min，染色结束后加入500 μL PBS以终止反应并上机检测。

1.5 Western blot实验

收集的细胞用RIPA 细胞裂解液裂解，超声破碎后用12 000 g离心10 min，收集上清采用BCA法测定蛋白浓度，取蛋白样品与5X蛋白上样缓冲液混匀，95 ℃金属浴5 min。配制并灌注12%的分离胶和5%浓缩胶，每孔上样蛋白30 μg左右。80 V (30 min)，120 V (90 min)的电泳结束后采用湿转法转膜，300 mA (60 min)。转膜结束后，用5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h以上，加入一抗4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗涤10 min 2次，加入HRP标记二抗室温孵育2 h。再次TBXT 洗涤10 min 2次，ECL发光显影。分别检测Bax和Bcl-2，以及蛋白质上样内参GAPDH的表达。结果用Quantity One凝胶图像分析系统进行条带的灰度分析。

1.6 Caspase-3的活性检测

按照碧云天的Caspase-3的活性检测试剂盒(C1115)说明书进行实验。

1.7 细胞ROS阳性率的检测

收集细胞，重悬细胞于孵育缓冲液中，加入ROS Fluorescent Probe-DHE至终浓度为2 μM，并置于37 ℃避光孵育15 min。孵育缓冲液洗涤细胞1次，800 r/min离心5 min，加入400 μL PBS重悬细胞并上机检测。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 流式细胞仪检测细胞凋亡的结果

① 不同静脉铁剂对HPBMC细胞凋亡的影响: 4种静脉铁剂处理组的细胞凋亡率分别是Is (42.38±2.74)%，Id (40.51±2.13)%，Fg (41.79±2.82)%，Fc (40.47±1.97)%，均明显高于对照组(20.13±1.16)%(P<0.01)，且4组之间无显著差异(P>0.05)。见表1; ② 维C干预对Id诱导的HPBMC细胞凋亡的作用: Id+维C干预组的细胞凋率为(29.09±1.29)%，明显低于Id处理组(40.51±2.13)%(P<0.05)。见表1。

2.2 Western blot分析结果

① Id对HPBMC促凋亡基因Bax，以及抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达的影响(图1): 采用Quantity One凝胶图像分析系统分析杂交条带的灰度值，结果显示：Id处理组的Bax，Bcl-2蛋白表达量分别是对照组的(2.09±0.21)，(0.46±0.11)倍，(P<0.05); ② 维C干预对Id诱导Bax和Bcl-2蛋白表达的作用(图1): Id+维C干预组的Bax，Bcl-2蛋白表达量分别是对照组的(1.13±0.25)，(0.87±0.16)倍，维C干预降低了凋亡基因Bax的表达，增加了抗凋亡基因Bcl-2的表达，(P<0.05)。

表1 不同静脉铁剂对HPBMC细胞凋亡率的影响及维C的干预作用 %

与CTRL比较，*P<0.05；与Id比较，#P<0.05。

2.3 Caspase-3的活性检测结果

① Id对HPBMC凋亡分子Caspase-3活性的影响(图2): 测得各组405 nm吸光度值后，与对照组相比，结果显示：Id处理组的Caspase-3活性是对照组的(3.51±0.33)倍(P<0.05); ②维C干预对Id诱导的Caspase-3活化的作用(图2): Id+维C干预组的Caspase-3活性是对照组的(1.87±0.26)倍，维C干预降低了凋亡分子Caspase-3的活性(P<0.05)。

2.4 流式细胞仪检测HPBMC细胞ROS阳性率的结果

① Id对HPBMC细胞ROS阳性率的影响(图3): Id处理组的细胞ROS阳性率为(68.32±4.57)%，明显高于对照组(42.87±4.05)%(P<0.05); ② 维C干预对Id诱导的细胞ROS生成量增加的作用(图3): Id+维C干预组的细胞ROS阳性率为(53.79±4.11)%，明显低于Id处理组(68.32±4.57)%(P<0.05)。

图2 Id对HPBMC凋亡分子Caspase-3的影响及维C的干预作用

3 讨 论

铁是十分重要的微量元素，参与构成多种活性酶，也是血红蛋白中O2的载体。但是MHD患者由于摄入不足、透析过程中丢失、胃肠道慢性失血等原因，常出现缺铁性贫血[10]，因而临床上常采用静脉铁剂给其补铁。但是静脉补铁后，体内游离铁增加，通过Fenton /Haber-Weiss反应催化产生代表ROS的羟基和烷氧基，触发脂质过氧化，引起氧化应激反应加剧，促进微炎症状态，感染等并发症的发生发展[11-12]。临床研究[13]发现，口服或静脉补充维C，以及使用维C透析液都可以减轻补铁剂诱导的MHD患者氧化应激状态。目前，静脉铁剂诱导MHD患者氧化应激以及使用抗氧化剂维C对此进行干预都体现在患者体内氧化应激一系列指标的改变上，尚没有做深入研究。本研究采用体外培养的MHD患者HPBMC，探索静脉铁剂对其凋亡的影响以及维C对此过程的干预作用，欲探索静脉铁剂诱导MHD患者氧化应激，促进微炎症状态，感染等并发症的发生发展的内在机制是否与HPMBC的凋亡有关。

A为对照组; B为Id处理组; C为Id+维C干预组

HPMBC主要包括T、B淋巴细胞及少量单核细胞，其增殖与凋亡之间的动态平衡是维持人体正常防御与监视功能的保证。研究[14]发现，HPBMC的凋亡与MHD患者细胞免疫功能缺陷密切联系。细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，凋亡早期，位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸(PS)可迁移至细胞外侧， Annexin V可与PS发生特异性结合，是目前流式细胞定量检测细胞凋亡的首选方法。本研究采用此法发现4种静脉铁剂处理的MHD患者HPMBC后，其凋亡率显著高于对照组(表1)，证实静脉铁剂可诱导MHD患者HPMBC的凋亡，与文献[15]报道相一致。进一步采用Western blotting分析法和Casepase-3活性检测试剂盒检测发现静脉铁剂Id处理的HPBMC细胞促凋亡因子Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少(图1)，凋亡分子Casepase-3被激活(图2)，说明静脉铁剂处理会激活HPBMC细胞内的凋亡信号。这些结果都证实，静脉铁剂能够诱导MHD 患者HPBMC的细胞凋亡。

作为免疫细胞，HPBMC易被细胞因子和线粒体氧化损伤所激活，ROS生成量增多，凋亡信号激活，进而发生凋亡，这提示静脉铁剂对HPBMC凋亡的诱导可能与其促进细胞氧化应激和线粒体氧化损伤有关。故本研究探索了静脉铁剂对HPBMC细胞ROS生成量的影响，FCM检测结果发现Id处理的HPBMC细胞ROS阳性率明显高于对照组(图3)，证实了静脉铁剂能加剧HPBMC的氧化损伤程度。鉴于维C在临床上用于改善静脉铁剂诱导MHD患者氧化应激状态，本研究进一步探索了维C对静脉铁剂诱导的HPBMC的氧化应激和细胞凋亡的干预作用。结果发现维C干预能使Id处理的HPBMC细胞促凋亡因子Bax表达下调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加(图1)，凋亡分子Casepase-3活性下降(图2)，ROS生成量减少(图3)，最终抑制了静脉铁剂Id诱导的HPBMC细胞凋亡。因此(表1)，本研究在体外验证了抗氧化剂维C能减轻静脉铁剂Id诱导的MHD患者HPBMC的ROS生成和细胞凋亡。

综上所述，本研究证实静脉铁剂能加剧体外培养的MHD患者HPBMC细胞的氧化应激状态，并诱导细胞凋亡，维生素C对此的干预作用也与临床报道相符。这可能是静脉铁剂诱导MHD患者氧化应激，促进微炎症状态，感染等并发症的发生发展的内在机制之一。

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