应用微卫星标记对两个豚鼠封闭群的遗传学研究

李芳芳，魏 杰，王 洪，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

豚鼠因为其特殊的生物学特性和生理解剖特点，被广泛应用于各个医学和药学的研究领域。目前，国内使用的豚鼠多为Hartley品系，属于封闭群，遗传结构呈杂合性[1]，由于缺乏有效地遗传监测，其实际遗传背景和遗传多样性尚不清楚。为保持豚鼠的基因杂合度及遗传稳定性，对豚鼠的遗传质量实行监测成为重要的课题，而开发一套基因组分子标记是检测的前提[2,3]。微卫星DNA是一类以1-6bp核苷酸为基本序列的多次串联重复序列，由于重复序列的数目不同，产生了DNA的多态性，又称简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)或短串联重复(short tandem repeats)。微卫星标记应用于实验动物的遗传检测已被证明具有独特优势和良好前景[4-7]，特别是其高度多态性及位点充足的特点，尤其适用于封闭群的遗传检测[8]。

本研究应用筛选获得的25个多态性微卫星标记结合荧光标记-半自动基因分型技术，对北京的两个豚鼠封闭群进行了遗传多态性分析，为封闭群豚鼠遗传检测方法和标准的建立提供基础技术支撑。

1 材料和方法

1.1 实验动物

豚鼠为Hartley，分别来自两个封闭群。A群为1994引自日本，封闭至今，动物36只，许可证号SCXK(京)2009-0017；B群2004年从Charles River引入,动物28只，许可证号SCXK(京)2012-0001。动物使用许可证号SYXK(京)2011-0008.

1.2 主要试剂及仪器

试剂：1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mol/L EDTA-2Na (pH 8.0), 6 mol/L NaI, 50×TAE, 氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇，Taq聚合酶，dNTP，10× PCR buffer，D2000 plus marker，琼脂糖等，为宝如亿(北京)生物技术有限公司产品。

仪器：PCR仪 (Bio-Rad公司)，核酸琼脂糖凝胶电泳仪(Bio-Rad公司)，离心机(美国Thermo Fisher公司)，电子天平(Mettler GB303)等。

1.3 引物选择及筛选

根据相关文献[9-11]，初步选择多态性好的40个豚鼠微卫星位点进行实验，通过PCR扩增最终筛选出25个微卫星位点进行研究，引物信息见表1，所有引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成并进行荧光标记。

1.4 方法

1.4.1 基因组DNA的提取：采取心脏采血，每只豚鼠采500 μL血样，并立即注入4 mL EDTA抗凝真空采血管中，充分摇匀并编号。参照《分子克隆指南》[12]及Loparev VN等[13]方案，NaI法提取抗凝血基因组DNA。

1.4.2 PCR扩增：25 μL反应体系：灭菌dd H2O 18.3 μL；10× PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL；dNTP (2 mM) 2.0 μL； 上游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；下游引物 (10 pmol/μL) 0.5 μL；；模板 (30 ng/μL) 1.0 μL；Taq酶(2.5 U/μL) 0.2 μL。

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR试剂为宝如亿(北京)生物技术有限公司产品。

1.4.3 等位基因分离：2.5%的琼脂糖凝胶电泳分离产物，筛选出扩增效果好的产物进行STR扫描。共选取三种荧光标记，分别为FAM、HEX和TAMRA。

1.4.4 数据统计分析：用GeneMapper4.0软件分析STR扫描结果，读取等位基因片段大小，通过PopGen 1.32软件计算观测等位基因数、有效等位基因数[14]、观测杂合度、期望杂合度、F-统计量、Shannon信息指数、Nei遗传相似度及遗传距离[15,16]等指标。在线软件GenePop对各位点进行Hardy-Weinberg平衡检验及杂合子缺失检验。PIC_CALC软件对每个位点进行多态信息含量(PIC)分析。

2 结果与分析

2.1 各微卫星位点在总群体上的遗传分布

统计25个微卫星位点在两个豚鼠群体各个体的基因型，计算各位点的观察等位基因数、有效等位基因数、观察杂合度、期望杂合度、Shannon信息指数、多态信息含量、F-统计量，结果见表2。25个微卫星位点在两个群体中共发现121个等位基因，每个位点2～10个，平均4.84个。有效等位基因数在1.0812～7.0865之间，平均为3.148；观察杂合度在0.0781～0.8281之间，平均为0.4726；期望杂合度在0.0757～0.8656之间，平均为0.6070；Shannon信息指数在0.165～2.0572之间，平均为1.1702；多态信息含量(PIC)在0.072～0.843之间，平均为0.552。

表1 25个豚鼠微卫星位点的相关信息

表2 25个微卫星位点在总群体上的遗传分布

2.2 两群体遗传多样性比较

如表3所示，A群和B群分别检测到103和116个等位基因；平均观察杂合度分别为0.4467和0.5062；平均期望杂合度分别为0.5195和0.5838；平均多态信息含量分别为0.459和0.518。可以看出，B群的豚鼠群体遗传多样性稍大于A群。

2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验

本研究采用马可夫链法[17]计算两个群体每个位点Hardy-Weinberg遗传平衡检验的精确P值[P(HWE)]、杂合子缺陷P值[P(ht.def)]与杂合子过多的P值[P(ht.exc)]，并计算相应的Fis (W&C)和Fis (R&H),结果见表4。A种群有5个位点显著偏离Hardy-Weinberg遗传平衡[P(HWE)<0.05 ],偏离平衡的这5个位点中有4个表现出杂合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]；B种群有6个位点显著偏离Hardy-Weinberg遗传平衡[P(HWE)<0.05 ],偏离平衡的这6个位点中有5个表现出杂合子缺陷[P(ht.def)<0.05 ]。

2.4 群体间遗传关系

遗传分化系数(Fst)和遗传距离结果见表2。两个群体25个位点的Fst范围从0.0043到0.4656，平均为0.1056。两群体的Nei’s(1972) 遗传距离和Nei’s(1978)无偏遗传距离分别为0.3302和0.3204。

表3 两个封闭群豚鼠的遗传多样性

Nei: Nei's (1973) expected heterozygosity

表4 两群体的Hardy-Weinberg平衡及杂合子缺失和过多检验

3 讨论

3.1 两个封闭群豚鼠遗传多样性

有效等位基因数是基因纯合度的倒数，反映了等位基因的相互影响，可作为群体遗传变异的一个指标[18]。杂合度或群体平衡状态是群体遗传结构分析最直接和最有效的方法，杂合度值越高所在群体的遗传多样性就越丰富，较理想的封闭群体的杂合度值应介于0.5～0.7。多态信息含量是表示微卫星座位多态性高低的一个指标。当微卫星座位PIC>0.5时，表明该遗传标记具有高度的可提供遗传信息性，为高度多态性座位；当0.25

根据Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果，A种群豚鼠在5个位点显著偏离遗传平衡，B种群豚鼠在6个位点显著偏离遗传平衡，并且两个种群偏离平衡的位点，大多表现为杂合子缺陷。导致这一现象的原因除了无效等位基因之外，大部分的偏离可能是在饲养繁殖过程中未能实现随机交配，近交程度有所升高导致的。实验动物封闭群Hardy-Weinberg平衡偏离现象似乎是其繁殖过程中经常出现的一个问题[19，20]。目前由于封闭群动物普遍缺乏相应的遗传监测，因此在繁育过程中要遵守严格的操作程序以避免近交现象，同时，通过定期的遗传检测对其生产管理及繁殖方式等作出评估及调整是必需的。

3.2 两个封闭群豚鼠遗传关系

Fst是种群之间遗传差异的一种测度。F-统计量计算结果表明，两个种群在25个微卫星位点的平均Fst为0.1056，即群体间的遗传变异占总遗传变异的10.56%，89.44%的遗传变异来自群体内部的遗传多样性。依据遗传分化指数Fst的解释(介于0-0.05之间说明种群间分化很弱,0.05-0.15之间表示中等分化,0.15～0.25之间表示分化大,大于0.25表明分化极大)[21],说明两群体间的遗传分化已达到中等水平。

遗传距离以两个群体间同一座位上相同等位基因的频率差异的函数来测定,被用以描述群体的遗传结构和品种间的差异。两群体的Nei’s(1972)遗传距离和Nei’s(1978)无偏遗传距离分别为0.3302和0.3204，说明两群体间的亲缘关系较近。

本研究利用25个微卫星标记对两个种群封闭群豚鼠的遗传检测表明，两个种群均符合封闭群动物的群体遗传特征，遗传分化处于中等水平，B种群的多样性略高于A种群。Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果提示种群的繁殖过程中有不同程度的近交现象存在。本研究结果可为封闭群豚鼠遗传检测方法和标准的建立提供基础资料。

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