新型醛酮还原酶不对称转化制备(S)-N,N-二甲基-3-羟基- 3-(2-噻吩)-1-丙胺

郭荣云，聂尧，穆晓清，徐岩，2，肖荣

（1江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；2江南大学食品生物技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；3罗格斯大学高级生物技术与医学中心，新泽西州 08854，美国）

度洛西汀，化学名(S)-N-甲基-3-(1-萘氧基)-3-(2-噻吩基)-1-丙胺，商品名为Cymbalta，是一种有效抑制5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI）。临床上用其盐酸盐治疗重症抑郁症、糖尿病性外周神经疼痛及女性应激性尿失禁。在与度洛西汀具有相同化学组成的两种同分对映异构体中，只有(S)-构型具有抗抑郁的药理活性[1]。目前，由于起始原料不同，不对称合成手性度洛西汀的方法很多[2]。其中，(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）是制备度洛西汀的重要手性中间体，因而通过(S)-专一性不对称还原N,N-二甲基- 3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）已成为高效制备度洛西汀的一种重要途径。

微生物法还原羰基化合物以其高效、专一、反应条件温和、立体选择性好等优点，已成为制备手性醇的重要手段[3-4]。目前，已筛选得到多株能够不对称还原制备度洛西汀中间体的微生物，如Exiguobacteriumsp.[5]、Thermoanaerobactersp.[6]、Candida tropicalis[7]、C. viswanathii[8]等。其中C. tropicalis、C. viswanathii能够全细胞催化DKTP还原生成(S)-DHTP，并获得＞80%的转化率和高对映体过量值(＞99%)，但反应底物浓度仍较低，反应效率仍较为有限[7-8]。这可能是由于其细胞或胞内功能酶的性质局限性以及全细胞的细胞膜结构阻碍底物（DKTP）与酶的相互作用，从而影响时空产率[9]，进而大大限制了其工业应用。而且，目前国内度洛西汀手性中间体的研究较少，且水平较低[10]。因此，有必要开发新型高选择性的还原酶及其不对称催化转化的反应体系，以实现(S)- DHTP的高效生物反应制备。

近年来，直接利用已有的数据库进行新型催化剂的开发已逐渐发展成为一种实现生物转化的有效手段[11-12]。在微生物催化立体选择性氧化还原反应的研究中，C. parapsilosis表现出显著的催化特性，是比较突出的立体选择性氧化还原酶酶源[13]，如醛酮还原酶[14]、中链脱氢酶[15-16]、短链脱氢酶[15]。目前，C. parapsilosis中用于不对称转化的醛酮还原酶的开发应用比较有限[17]，因此有必要进一步挖掘新型的醛酮还原酶用于催化DKTP的不对称转化。本研究利用C. parapsilosis的基因组信息，从C. parapsilosisCCTCCM-203011中得到8个新型的醛酮还原酶，重组表达后，用其构建粗酶反应体系，催化还原N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）生成(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP），见图1。

1 材料与方法

1.1 实验材料

Candida parapsilosis CCTCCM 203011菌株来自本实验室收藏，Escherichia colistrain XL-10 Gold、E. coliBL21 (DE3) 、pET21c质粒购于美国Novagen公司，基因操作试剂均购自大连宝生物有限公司。

图1 粗酶体系催化还原DKTP生成 (S)-DHTP

N,N-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DKTP）、(S)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺（DHTP）均购自浙江九洲药业股份有限公司；氨苄青霉素、 IPTG均购自上海生工生物技术有限公司；辅酶NADPH、NADP+均购自上海索莱宝生物科技有限公司；正己烷（色谱纯）、异丙醇（色谱纯）均购自Tedia公司；其他分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组菌株的构建和菌体培养

使用在线分析软件NCBI（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）利用C. parapsilosis基因组数据库（http：//www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/ parapsilosis/）在C. parapsilosisCCTCC M203011中挖掘得到8个同源醛酮还原酶序列，见表1[18-19]。设计引物（表1）扩增获得醛酮还原酶编码区基因，构建重组质粒pET21c，将重组质粒转化到E.coliBL21 (DE3) 感受态细胞中进行活性表达。

重组大肠杆菌在含50µg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中于37℃、200r/min 振荡培养至OD600达到0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于17℃、200r/min 诱导表达12h。

1.2.2 粗酶液的制备

将诱导表达后的发酵液于8000r/min离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤3次，重悬于0.1mol/L磷酸钾缓冲液（pH=6.5）中（细胞浓度为100g/L），超声波破碎细胞。破碎条件：工作时间1s，间隔时间3s，总工作时间5min。4℃的条件下12000r/min 离心15min，收集上清液作为粗酶液用于不对称催化反应。

1.2.3 酶促不对称还原DKTP合成 (S)-DHTP

2mL磷酸钾缓冲液（0.1mol/L，pH=6.5）中含有1mL粗酶液（总蛋白含量5mg）及5g/L DKTP、辅助底物糖（醇）（10g/L）、NADPH（0.1mmol/L）和NADP+（0.1mmol/L），置于30℃、200r/min的摇床中L反应24h。反应结束后，加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用高效液相色谱仪分析产物光学纯度及产率。本文中的生物转化试验均重复3次，然后取其平均值。

1.2.4 产物DHTP的分析

产物分析在Agilent 1200型液相色谱仪上进行，色谱柱为Chiralcel OD-H柱 (4.6mm × 25cm；日本Daicel Chemical公司)，流动相为正己烷∶异丙醇（8∶2，体积比），流速为0.6mL/min，检测波长为241nm。(R)-DHTP及(S)-DHTP的保留时间分别为15.48min、16.78min，底物DKTP的保留时间为28.27min。

转化率（X）和产物ee值的计算公式如式（1）、式（2）。

表1 基于基因组数据库挖掘得到的潜在醛酮还原酶基因及其引物序列

式中，Co为底物的初始浓度；CP为反应终止时产物的浓度；CS、CR分别为 (S)-DHTP、(R)-DHTP 的浓度。

1.2.5 催化反应条件的优化

在1.2.3节的不对称反应条件下，在1g/L DKTP时，考察8个醛酮还原酶重组菌不对称还原 DKTP 的能力，筛选出能够高立体选择性催化还原生成光学活性 (S)-DHTP 的优良菌株。在此基础上，在5g/L DKTP时考察了辅底物、辅酶浓度、反应温度、反应初始pH值、底物浓度对重组大肠杆菌粗酶液反应体系不对称还原DKTP生成光学活性(S)-DHTP的影响，旨在优化催化反应条件。

2 结果与讨论

2.1 不对称还原DKTP的新型醛酮还原酶的基因组挖掘

利用C. parapsilosis的基因组信息，通过与conjugated polyketone reductase C1的序列相似性挖掘得到8个醛酮还原酶（CPARs）基因核苷酸编码序列，这些序列编码蛋白的一级结构与conjugated polyketone reductase C1具有15%～42%的同源性，说明通过基因组挖掘得到的读码框序列编码新型的潜在醛酮还原酶。利用重组大肠杆菌分别表达8种潜在醛酮还原酶编码基因，构建了醛酮还原酶工具箱。这8株重组大肠杆菌经细胞培养、细胞破碎后，进行粗酶催化反应，筛选能够高立体选择性不对称还原 DKTP 生成光学活性的 (S)-DKTP的醛酮还原酶，结果见表2。酶促不对称还原DKTP发现，CPARs 均为NADPH依赖型（结果未显示），CPAR4在DKTP 1g/L时，产物ee值大于99%，产率达到 95.2%，具有不对称还原DKTP生成 (S)-DHTP的立体专一性。

表2 不同醛酮还原酶催化还原 DKTP 的特性对比

2.2 粗酶体系催化还原DKTP生成(S)-DHTP的 研究

目前，醛酮还原酶不对称催化还原羰基化合物的主要反应类型为全细胞、纯酶、粗酶催化。其中，全细胞催化因能利用细胞自生的辅酶代谢途径进行辅酶再生而备受关注，但全细胞的细胞膜结构阻碍底物（DKTP）与酶的相互作用，从而影响其时空产率[9]，进而大大限制了其工业应用；纯酶催化因具有较高的反应速率和较少的副反应而优势明显，但酶纯化及辅酶添加（或建立辅酶再生体系）会大大提高反应成本；粗酶催化因含有细胞内部全部的酶，能够利用其中自有的酶系统构建自组装的辅酶循环系统，解决细胞膜对底物（DKTP）的屏障及辅酶循环问题。因此，本研究采用CPAR4粗酶液构建粗酶体系催化还原DKTP生成(S)-DHTP的 研究。

2.2.1 辅助底物对粗酶体系转化反应的影响

由于醛酮还原酶在催化立体选择性氧化还原反应过程中，需要辅助底物作辅酶循环系统的供氢体，因此，有必要研究辅助底物对反应的影响。因此本研究选择多种糖类（蔗糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、果糖、乳糖）和醇类（甘油、乙醇、异丙醇、山梨醇）作为辅助底物进行研究，考察其对转化作用的影响，结果如表3所示。实验结果显示，多种糖类及醇类能够作为此自组装辅酶循环系统的辅助底物。其中糖类中效果最好的是果糖和乳糖，在四种醇类中效果最好的是乙醇和异丙醇。多种糖类及醇类对反应的促进作用暗示了粗酶体系中存在多种可以用作辅酶循环的酶类。由于乳糖可被细胞粗酶液中的水解酶类水解为半乳糖和葡萄糖，其在粗酶液中的代谢过程伴随着辅酶的产生，这可能解释乳糖对反应具有最佳的促进作用。虽然乙醇、异丙醇对催化反应也具有较佳的促进作用，但其促进作用仍低于乳糖，且醇类化合物的极性大对生物催化剂易产生抑制作用[20]。综合考虑，本研究选择乳糖作为辅助底物进行下一步研究。

表3 辅助底物对粗酶体系不对称还原DKTP的影响

2.2.2 辅酶浓度对粗酶体系转化反应的影响

TTN（total turnover number，TTN）指每摩尔辅酶所能生成的目的产物的摩尔数，是衡量辅酶利用效率的一个重要指标，以及评价辅酶再生方法是否具备良好再生能力和应用前景的一个重要指标。因此，本研究考察了辅酶NADPH和NADP+浓度对反应的影响，如表4所示。结果显示NADP+和NADPH浓度对反应影响基本一致，由于氧化型辅酶NADP+的价格低于还原性辅酶NADPH的价格，NADP+作为辅酶用于反应是一个更为经济的选择。在底物浓度为5g/L，NADP+浓度为0.01mmol/L时，反应的TTN可达883，但其产率仅有32.4，当NADP+浓度为0.02mmol/L时，反应的TTN为852，产率为62.5%。在兼顾产率及TTN的情况下，NADP+浓度为0.02mmol/L是最适辅酶浓度。

2.2.3 反应温度对粗酶体系转化反应的影响

由于粗酶体系中细胞内部的酶类失去了细胞膜 的保护，对温度非常敏感。因此有必要研究温度对粗酶催化的不对称反应的影响，如图2所示。研究结果表明，反应的温度对产物的产率和光学纯度都有一定的影响，在温度低于30℃时，随着温度的升高，产物产率逐渐增大，产物的光学纯度保持在99%以上；而当反应温度高于30℃时，随着温度的升高，产物产率和光学纯度都减小，一方面由于高温使酶失活，产率减小；另一方面当反应温度超过30℃时，可能由于酶立体选择性的改变导致产物光学纯度降低。因此，30℃为反应最适温度，产物ee值为99%，产物产率可达70.9%。

表4 辅酶浓度对粗酶体系不对称还原DKTP的影响

图2 温度对粗酶体系不对称还原DKTP的影响

2.2.4 反应pH值对粗酶体系转化反应的影响

在生物催化的反应过程中，反应体系的pH值不仅会影响酶的构型、稳定性以及活性中心的解离状态，还会影响辅酶体系和反应中氢传递及电子转移。生物催化体系pH值对DKTP的不对称还原效率的影响如图3所示。研究结果表明，初始pH值小于6时，CPAR4的产率及光学纯度受影响较大，随着pH值的升高，产物产率及光学纯度逐渐增大；而pH值大于6时，CPAR4的产率及光学纯度受影响较小。因此，pH=6.5为反应最适pH值。

2.2.5 底物浓度对粗酶体系转化反应的影响

图3 pH值对粗酶体系不对称还原DKTP的影响

图 4 底物浓度对粗酶体系不对称还原DKTP的影响

对于传统的化学催化剂来说，生物催化剂的主 要劣势在于较低的底物耐受性。底物浓度对不对称还原反应催化的影响如图4所示，在底物浓度小于3g/L时，随着底物浓度的升高，产率略有下降；当底物浓度为3g/L时，产率依然达到94.5%。继续提高底物浓度时，产率有一定的下降。当底物浓度为5g/L 时，产率达到71.2%，且底物浓度进一步增加至6g/L时，产率仍有50%左右。说明底物DKTP本身对粗酶体系有较大影响，且该酶体系对高浓度的DKTP具有一定的耐受性。

3 结 论

本研究利用C. parapsilosis的基因组信息，挖掘得到8个新型的醛酮还原酶（CPARs）基因，构建醛酮还原酶工具箱（重组大肠杆菌分别表达8 种醛酮还原酶）。在构建的8株重组菌中，CPAR4能够高立体选择性地不对称还原DKTP得到 (S)-DHTP。为进一步提高底物DKTP的转化率、构建CPAR4的粗酶催化反应体系，此反应体系需要乳糖作为辅助底物以及极少量NADP+作为起始辅酶。通过此粗酶反应体系的优化，3g/L的DKTP产率达到94.5%，光学纯度大于99.9%，这与目前报道的最高水平相当[21]。研究结果进一步证明，基于基因组信息挖掘，可以有效获得用于制药和精细化工行业的新型高效生物催化剂。此外， 针对生物催化不对称氧化还原反应的传质、电子传递等问题，建立具有自身辅酶再生能力的粗酶催化体系具有一定的应用潜力。

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