耐力运动对营养性肥胖小鼠骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬的影响

崔 迪，邱守涛，王海燕，贺 杰，漆正堂，孙 易，丁树哲

耐力运动对营养性肥胖小鼠骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬的影响

崔 迪，邱守涛，王海燕，贺 杰，漆正堂，孙 易，丁树哲

目的：探讨耐力运动对营养性肥胖小鼠骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬的影响及其分子机制。方法：采用6周高脂膳食干预诱导生长期ICR雄性小鼠营养性肥胖模型，建模成功后随机分为高脂膳食对照组(HC，6只)、普通膳食干预组(HN，6只)及普通膳食联合耐力运动干预组(HNE，6只)，另选造模对照ICR小鼠为普通膳食对照组(NC，6只)，HC组小鼠持续喂养6周高脂膳食，NC、HN、HNE饲以普通膳食，HNE组小鼠进行6周跑台耐力训练，速度按周递增即15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min、35 m/min，40 min/次，6次/周。末次训练24 h后处死小鼠并采样，应用JC-1探针法检测线粒体膜电位，RT-PCR及Western Blotting技术检测相关基因及蛋白表达情况。结果：1)6周高脂膳食可诱导小鼠体重、LEE’s指数及附睾脂肪百分比显著增加(P<0.05)，BG、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量显著增加(P<0.05)；2)与HC比，HNE组骨骼肌MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱc表达均显著增加(P<0.05)，HN、HNE组MHCⅡb mRNA表达均下调；3)与NC比，HC组骨骼肌线粒体膜电位显著降低(P<0.05)，HC、HN、HNE组小鼠骨骼肌mtDNA拷贝数量下降(P<0.05)；4)与NC组比，HC组小鼠细胞自噬相关信号分子ATG13、LC3 mRNA表达下调，P62 mRNA表达上调；HN、HNE组 BECN1、ATG13及LC3 mRNA含量显著增加(P<0.05)，HC组LC3Ⅱ/Ⅰ比值下降，HN、HNE组小鼠骨骼肌p62蛋白水平下降，HNE组LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调；5)HC组NIX mRNA表达与NC组比下调，而在HN、HNE组含量增加；HNE组PARK2、PARL mRNA较HN组上调；HC组PINK1蛋白含量有所下调，而在HN及HNE组普遍上调(P<0.05)。结论：1)长期高脂膳食干预可诱导营养性肥胖发生，引起机体代谢紊乱、骨骼肌线粒体功能异常；2)耐力运动结合膳食改善可有效控制营养性肥胖小鼠体重并促进肌球蛋白的表达；3)耐力运动结合膳食改善可缓解营养性肥胖机体细胞自噬水平的下降，而对线粒体自噬的影响主要通过作用于PINK1/Parkin信号以调控骨骼肌线粒体的数量和功能。

耐力运动；营养性肥胖；细胞自噬；线粒体自噬；PINK1/Parkin

肥胖发生伴随机体代谢紊乱、胰岛素抵抗，逐渐成为威胁人类健康的重要因素，现代人尤其我国青少年及儿童高脂、高热量的饮食习惯是肥胖发生的主要原因之一。细胞自噬是从真核细胞到哺乳动物高度保守的重要亚细胞事件之一，指细胞在应激情况下可对胞内内容物包裹，并与溶酶体融合降解为生物大分子，重新被细胞利用的过程，目前研究表明，细胞自噬与多种代谢性及退行性疾病发生密切相关[38]。有研究证实，在外周及中枢组织中运动或热量限制可激活细胞自噬，是运动促进人类健康的重要分子机制[12,20]，同时，细胞自噬激活剂雷帕霉素的介入可有效阻断高脂膳食诱导的肥胖发生[19]。已知，耐力训练可有效动员脂肪供能及增加骨骼肌胰岛素敏感性防治肥胖发生。那么，在此过程中运动诱导的细胞自噬变化如何尚不得而知[14]。

骨骼肌是平衡机体能量代谢及胰岛素敏感性的重要组织，而肌细胞内线粒体是机体能量代谢工厂及信号调控中心之一。线粒体功能正常与否直接影响机体健康，已知神经退行性疾病，如帕金森综合征(Parkinson Disease,以下简称PD)、阿尔兹海默病(Alzheimer Disease，以下简称AD)及代谢相关疾病，如Ⅱ型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,以下简称T2DM)、癌症等均与线粒体功能障碍密切相关，因此，维持胞内线粒体数量和功能的相对稳定与退行性及代谢性疾病的防治密切相关[9,17,33,41]。线粒体自噬也是典型细胞自噬的一种，从真核生物到高等动物普遍存在，指受损线粒体无法通过自我修复或参与线粒体动态变化被重新利用，被自噬体包裹后与溶酶体融合而降解的过程，低氧、营养缺乏、Ca2+下降和活性氧(Reactive Oxygen Species,以下简称ROS)增多等应激情况均可激活线粒体自噬，线粒体自噬异常可导致受损线粒体堆积，引发线粒体功能障碍[48]。高脂膳食诱导的肥胖机体中，伴随氧化应激异常及线粒体功能障碍，而在此过程中线粒体自噬机制是否参与其中鲜见相关报道[13]。

近年来研究表明，机体运动所触发的应激信号尤其是相关激酶信号的激活可有效促进骨骼肌线粒体生物发生并维持线粒体功能，亦可作用于线粒体自噬促进受损线粒体的清除，但其分子机制仍待进一步研究[1,3,40]。耐力训练作为防治肥胖的一种干预手段能否通过对细胞自噬和/或线粒体自噬的调控参与代谢性疾病的防控？本研究通过高脂膳食诱导生长期小鼠营养性肥胖模型并对其进行膳食改善及运动干预，探讨耐力训练及高脂膳食对骨骼肌细胞自噬和线粒体自噬的影响，旨为代谢性疾病的运动防治提供理论及数据支撑。

1 材料与方法

1.1 建立营养性肥胖小鼠模型

4周龄清洁级ICR(Institute for Cancer Research)雄性小鼠90只，体重34.3±3.41 g，由上海斯莱克动物实验中心提供。随机分为普通膳食组(C，12只)及高脂膳食造模组(78只)；根据肥胖易感模型筛选规律，6周高脂膳食干预后选取高脂膳食造模组体重增量较大的小鼠为高脂膳食组(H，24只，约1/3)[24,32]。实验所用饲料由上海市斯莱克动物实验中心提供，普通膳食及高脂膳食中粗蛋白、脂肪及碳水化合物能量比例分别为17∶14∶48及20∶40∶40；普通饲料含水9.2%、粗蛋白21.1%、粗脂肪5.28%、粗灰粉5.2%、粗纤维4.12%及其他无机盐与必需氨基酸等；高脂饲料含54.6%普通饲料，另添加猪油16.9%、蔗糖14%、预混料2.1%、酪蛋白10.2%及麦芽糊精2.2%。持续喂养6周后，从C组和H组分别随机挑选6只，摘眼球取血后脱臼处死，取附睾脂肪称重，结合血糖、血脂指标评价造模效果。

1.2 实验动物分组

营养性肥胖小鼠模型建立成功后，将C组剩余6只作为对普通膳食对照组(NC，6只)，将H组剩余18只随机分为高脂膳食对照组(HC，6只)、普通膳食干预组(HN，6只)及普通膳食联合耐力运动干预组(HNE，6只)。HC组小鼠持续喂养高脂膳食，NC、HN、HNE饲以普通膳食，HNE组小鼠进行6周跑台耐力训练，速度按周递增即15 m/min、22 m/min、27 m/min、31 m/min、35 m/min、35 m/min，40 min/次，6次/周，周日休息，跑台坡度为0%。末次训练24 h后处死小鼠，取一侧腓肠肌冰上匀浆抽提线粒体，其他骨骼肌分置冻存管于液氮中速冻，-80℃超低温冰箱保存，待测。

1.3 线粒体膜电位测定

线粒体抽提采用Rasmussen实验室方法进行[37]。以JC-1(四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物)用作检测线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP)△ψ的荧光探针。按Beyotime C2006说明书推荐比例稀释JC-1，配制染色工作液，Tecan 2000型酶标仪检测荧光信号。蛋白定量采用BCA法。

1.4 Real- Time PCR

冰上取腓肠肌约20 mg，按照Beyotime D0063哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒说明书提取DNA，检测各组线粒体DNA(Mitochondrial DNA,以下简称mtDNA)相对含量(mtDNA引物序列：F5′cgataatccccgctctacct3′，R5′agcccatttcttcccatttc 3′)；取腓肠肌约40 mg采用Invitrogen TRIZOL法提取总RNA，使用TOYOBO FSQ101反转录试剂盒合成第一链cDNA(15℃，5 min；37℃，15 min；85℃，5 min)，ABI StepOne型实时荧光定量PCR仪检测骨骼肌肌球蛋白相关基因、细胞自噬相关基因及线粒体自噬相关基因相对含量，荧光染料为TOYOBO QPK201 SYBR GREEN(实验所用引物由上海生物工程有限公司提供合成服务)。

1.5 Western blotting

取骨骼肌约50 mg冰上剪碎入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及IP裂解液说明书加入0.5 mL裂解液(含1 mM PMSF)，OMINI Bead Ruptor 24型磁珠匀浆机匀浆，14 000 g离心15 min，上清转入离心管，BCA法测定蛋白浓度后蛋白变性。采用10%、12%分离胶电泳，湿转法将蛋白转至PVDF膜；使用5%脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育12 h，TBST缓冲液清洗后，HRP标记二抗室温孵育2 h，Millipore ECL超敏试剂盒显影，AlphaFC2型凝胶成像系统进行冷光扫膜。实验所用抗体购于Santa Cruz或CST公司，使用FluorChem FC2软件对所捕捉图像进行灰度值分析。

1.6 数据统计

2 实验结果

2.1 高脂膳食诱导营养性肥胖模型的建立

6周膳食干预后，H组小鼠较C组体重、Lee’s指数及附睾脂肪百分比显著增加(P<0.05，表1)。

表 1 本研究小鼠体重、Lee’s指数及附睾脂肪百分比一览表

注：&&表示与C组比P<0.01；Lee’s指数=[体重(g)×1 000]1/3/体长(cm)。

与C组比，H组小鼠血糖(Blood Glucose,以下简称BG)、甘油三酯(Triglyceride,以下简称TG)、总胆固醇(Total Cholesterol,以下简称TC)、高密度脂蛋白胆固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,以下简称HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol,以下简称LDL-C)均显著增加(P<0.05，表2)。

表 2 本研究血液相关指标一览表

注：&表示与C组比P<0.05，&&表示与C组比P<0.01。

综上，6周高脂膳食喂养后H组小鼠形态学变化表现为体重、Lee’s指数及附睾脂肪百分比显著高于C组，且体重增长超过C组小鼠20%；血液相关指标表现为BG、TG、TC、HDL-C、LDL-C含量显著增加，提示高脂膳食诱导的营养性肥胖小鼠模型建立成功[5]。

2.2 耐力运动及膳食改善对营养性肥胖小鼠体重的影响

营养性肥胖小鼠在耐力运动及膳食干预开始前2周，HN、HNE组小鼠体重增幅逐渐下降，从第3周开始运动结合膳食改善对HNE组小鼠体重控制显著优于HN组(P<0.05，图1)。

2.3 骨骼肌肌球蛋白重链mRNA表达

本研究监测了小鼠骨骼肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc 4种类型mRNA表达，结果显示HC组与NC组在肌球蛋白重链各分型的转录水平无差异，而HNE组在耐力训练及膳食改善后表现为骨骼肌MHC Ⅰ、Ⅱa、Ⅱc表达均显著增加(P<0.05)，而HN、HNE组MHC Ⅱb mRNA表达均下调，这可能由于MHCⅡb负责快速力量素质，而本研究采用的跑台训练方式主要发展耐力素质(图2)。

注：&表示与NC组比P<0.05，&&表示与NC组比P<0.01；##表示与HC组比P<0.01；@表示与HN组比P<0.05，@@表示与HN组比P<0.01。

2.4 骨骼肌线粒体膜电位及mtDNA

HC组小鼠线粒体膜电位较NC组显著降低(P<0.05)，而在HN及HNE组小鼠骨骼肌线粒体膜电位有所回升；mtDNA相对含量结果显示，与NC组比，HC、HN、HNE各组小鼠骨骼肌mtDNA拷贝数量均下降(P<0.05，图3)。结果提示，高脂膳食诱发的营养性肥胖小鼠骨骼肌中线粒体功能及线粒体含量普遍下降，而6周耐力运动和膳食改善在一定程度上改善了线粒体膜电位的下降，但不足以逆转mtDNA含量的下降。

2.5 骨骼肌细胞自噬相关基因表达

与NC组比，HC组小鼠细胞自噬相关信号分子ATG13、LC3 mRNA表达下调，P62 mRNA表达显著上调(P<0.01)；HN、HNE组小鼠骨骼肌细胞自噬分子BECN1、ATG13及LC3 mRNA较HC组含量增加(P<0.05)，而调控自噬起始的信号分子ULK1 mRNA表达无变化，参与降解过程的分子P62 mRNA相对含量显著降低(图4)。Western Blotting数据显示，反映细胞自噬活性的重要指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在HC组骨骼肌中比值下降，伴随P62蛋白含量无变化，HN、HNE组小鼠骨骼肌P62蛋白水平下降，HNE组LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调，提示耐力训练联合饮食改善可有效缓解营养性肥胖小鼠骨骼肌自噬水平的异常。

图 3 本研究小鼠骨骼肌线粒体膜电位及mtDNA相对含量变化示意图

图 4 本研究小鼠骨骼肌自噬相关基因mRNA及蛋白表达示意图

2.6 骨骼肌线粒体自噬相关基因表达

HC组小鼠骨骼肌线粒体自噬信号PINK1、NIX mRNA表达与NC组比下调，而在HN、HNE组含量增加；HNE组小鼠线粒体自噬信号PARK2、PARL mRNA较HN组上调；PINK1蛋白含量在HC组有所下调，而在HN及HNE组普遍上调(P<0.05，图5)。结果提示，在营养性肥胖模型小鼠骨骼肌中线粒体自噬相关的PINK1/Parkin、NIX/BNIP3信号在转录及翻译水平均存在不同情况的异常，而饮食改善结合耐力训练干预可改善线粒体自噬水平，并且PINK1/Parkin信号相对于NIX/BNIP3信号的变化在骨骼肌中更加敏感。

图 5 本研究小鼠骨骼肌线粒体自噬相关基因mRNA及蛋白表达示意图

注：&表示与NC组比P<0.05，&&表示与NC组比P<0.01；#表示与HC组比P<0.05，##表示与HC组比P<0.01；@表示与HN组比P<0.05，@@表示与HN组比P<0.01。

3 分析与讨论

3.1 高脂膳食诱导营养性肥胖小鼠模型

肥胖是多种代谢综合征的表现形式，是T2DM、高血压、冠心病等疾病的诱因，然而引发机体肥胖的因素错综复杂，包括遗传、饮食习惯、生活方式、环境等。为探究能量过剩诱导的营养性肥胖及运动干预对骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬相关信号的影响，本研究利用高脂膳食建立小鼠肥胖模型并对其进行运动干预。由于实验动物存在肥胖易感性差异，因此，在营养性肥胖造模过程中本研究筛选了高脂膳食组体重增量较大的1/3作为研究对象，这在国内外营养性肥胖的研究中均有报道[24,39]。6周高脂膳食干预后，H组小鼠体重增长超过C组20%，血糖及血脂指标均显著增加，这与相关文献报道一致，提示营养性肥胖小鼠建模成功[5]。

3.2 耐力训练对营养性肥胖小鼠细胞自噬的影响

细胞自噬发生过程可分为自噬体成核、延伸、形成及降解等4个不同的阶段[15,16,30,46]。Atg1(Autophagy related gene 1)是酵母细胞自噬的起始因子，其哺乳动物同源基因为ULK1(Uncoordinated-51-Like Kinase 1)。自噬起始ULK复合体由ULK1/2、Atg13、Atg101及FIP200(Focal adhesion kinase family Interacting Protein of 200 kDa)组成[6,11]。正常生理条件下，雷帕霉素靶蛋白(mamalian Target of Rapamycin,以下简称mTOR)可使ULK1/2、Atg13磷酸化沉默从而抑制自噬启动，而当生长因子下降、营养缺乏时，引起相应胞浆Ca2+上调、组织缺氧、ATP合成下降，mTOR活性被抑制并解除了其对ULK1复合体的磷酸化水平，激活的ULK1复合体可磷酸化PIK3C3复合体(Phosphatidylinositol-3-kinase class Ⅲ Complex,PIK3C3 Complex)，使其从微管动力蛋白中分离并与生物膜相互作用，被认为是自噬体形成的初始信号[46]。自噬体成核及延伸过程以PIK3C3复合体为结构中心展开并通过UVRAG(UV-radiation resistance associated gene)或Atg14L连接生物膜，PIK3C3产生较多PI3P(Phasphatidyl-inositol-3-phsphate)可招募更多相关蛋白向自噬体组装，完成自噬体膜的延伸[43]。自噬体形成过程中，泛素样结构的形成至关重要，即Atg12-Atg5结合招募Atg16L形成三聚体后最终形成多聚复合体及LC3-PE(microtubule-associated light chain-3-Phosphatidylethanolamine,LC3-PE或LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ的形成已成为细胞自噬重要标志，目前研究者多利用LC3Ⅱ与LC3Ⅰ的比值反映细胞自噬水平[26]。在降解过程中，P62(Protein 62)分子参与连接自噬体膜与靶分子或细胞器并随自噬体降解而降解[44]。

细胞自噬这一重要的亚细胞事件被发现以来，人们不断探索其在代谢性及退行性疾病中的表征，研究运动及热量限制是否可通过对细胞自噬活性的调节促进人类健康。Wohlgemuth等研究发现雄性Fischer大鼠骨骼肌LC3及LAMP2(Lysosome-associated membrane protein 2) mRNA及蛋白表达均出现增龄性下降，而自主运动结合热量限制可上调LC3与LAMP2的表达保持骨骼肌中一定的自噬活性，促进细胞存活[47]。Grumati等研究发现C57BL/6小鼠胫骨前肌在一次性跑台训练1 h后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较对照组增加近4倍，表明一次训练后自噬活性的增加有利于受损细胞内容物的清除以维持细胞稳态[18,34]。Smuder等在研究阿霉素(Doxorubicin,以下简称DOX)治疗癌症引起肌萎缩副作用的过程中发现，耐力训练可适应性调节自噬活性，即通过调节BECN1(Beclin-1)、ATG7/9/12表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，对抗DOX所引起的自噬水平的过度激活，缓解肌萎缩[42]。Jamart等检测成年男子长跑前、后股外侧肌细胞自噬相关基因mRNA表达，结果显示，ATG4/12及LC3 mRNA的表达较运动前分别增加49%、286%、及103%，BNIP3基因表达增加113%，提示超长耐力训练可有效增加骨骼肌线粒体自噬水平[25]。Lee等研究发现，游泳耐力训练可抑制糖尿病SD大鼠骨骼肌萎缩，表现为LC3Ⅱ含量下降抑制细胞过度自噬[29]。由此，运动对细胞自噬活性的调控取决于机体所处生理状态，这也是机体对运动适应的结果。本研究发现，营养性肥胖小鼠骨骼肌ULK1、ATG13 mRNA下调，LC3 mRNA及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下调，P62蛋白含量增高，表明营养过剩的前提下骨骼肌自噬水平下调，这可能造成胞内代谢废物不能及时清除，细胞面临凋亡或坏死的风险；而耐力运动结合膳食改善可有效增加LC3Ⅱ的含量，使骨骼肌细胞自噬水平得以增加，维持细胞正常生理功能。本研究还检测了骨骼肌肌球蛋白重链的表达，未见肥胖小鼠与对照组间存在差异，提示肥胖动物模型并未发生骨骼肌萎缩这一并发症，而耐力训练结合膳食干预后MHCⅠ、Ⅱa、Ⅱc转录水平显著上调，提示本研究所采用的运动干预可靠，与Lee等的研究并不冲突。目前对肥胖机体骨骼肌细胞自噬的报道较少，然而Guo等人的研究证实通过药物激活细胞自噬可有效抑制肥胖发生，这与本研究通过耐力训练激活细胞自噬的研究结果相符[19]。Levinie团队的研究工作不仅在外周组织中检测到了运动对自噬的调节作用，还发现脑组织中细胞自噬的运动激活，她在Science杂志的专访中反复强调“运动的良药概念”，并认为细胞自噬是对运动健康促进作用的最好解释[12,20,21]。

3.3 耐力训练对营养性肥胖小鼠线粒体自噬的影响

线粒体是细胞内重要的亚细胞结构之一，是柠檬酸循环(Tricarboxylic acid cycle,以下简称TCA)及氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation,以下简称OXPHOS)进行的重要场所，有细胞“能量工厂”之称[17]。线粒体OXPHOS过程中，ROS作为副产物产生并攻击蛋白质、核酸、脂质等，引起细胞氧化应激；当过多的ROS产生时，线粒体结构或功能受损，此时异常线粒体则产生更多的ROS，导致过氧化恶性循环[10]。相应地，真核细胞在应激状态下存在一系列的线粒体发生、修复及清除机制，以维持胞内线粒体数量和功能的相对稳定，即线粒体质量控制(Mitochondrial Quality Control,以下简称MQC)，包括线粒体生物发生(核基因表达、线粒体基因表达与线粒体蛋白输入机制)、线粒体修复(抗氧化系统、泛素-蛋白酶体途径、线粒体基因修复等)、线粒体动态变化(融合与分裂)、细胞自噬和/或线粒体自噬均参与其中[2,10,17]。线粒体自噬从单细胞生物到哺乳动物普遍存在，是细胞自噬的一种，属于选择性细胞大自噬，指细胞内受损的线粒体被特异性包裹进入自噬体并与溶酶体融合，从而完成受损线粒体的降解，维持细胞内环境的稳定[2,4,22,48]。

已知运动可调控细胞自噬的水平参与骨骼肌代谢，但线粒体自噬作为选择性细胞大自噬的一种，其分子机制并非如细胞自噬一样高度保守。1966年，Duve首次报道了胰高血糖素作用下肝细胞内大量线粒体出现碎片化[8]。随后在酵母细胞及哺乳动物体内也先后发现了线粒体自噬，但直到2007年Mitophagy一词才由Insil Kim创造并用来表示细胞对线粒体选择性清除这一过程[27]。Atg32参与介导了酵母细胞中线粒体的清除，主要是Atg32与Atg8(与LC3同源)相互作用促进自噬体与线粒体结合；PINK1/Parkin信号参与了真核细胞线粒体自噬分子机制，正常情况下PINK1被线粒体输入机制(Protein imput machinery,PIM)输入到线粒体膜间隙，在PARL(Presenilins-associated rhomboid-like protein)分子的作用下降解，而当MMP下降时，PINK1定位到线粒体外膜并招募泛素连接酶Parkin，引起线粒体外膜蛋白的级联泛素化，抑制受损线粒体的流动性及其与“健康”线粒体融合的可能，并促进自噬体对其特异性识别并包裹，最终自噬体与溶酶体结合，受损线粒体得以降解[45,48]。另有报道表明，NIX/BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)信号参与了哺乳动物成熟过程中线粒体的清除过程，且参与线粒体修复及线粒体自噬过程，与MQC机制密切相关[2,48,49]。值得注意的是，参与以上3种经典线粒体自噬的分子机制迥异，并不存在同源类似物，而对骨骼肌线粒体自噬的信号目前认为主要是PINK1/Parkin参与介导，而亦有报道称参与红细胞形成过程中线粒体自噬的信号分子NIX以及BNIP3通过P53的转录靶基因Mieap (Mitochondrial eating protein)参与了线粒体的质量控制，其中，也包括其介导的线粒体自噬途径[7,35]。因此，本研究着重探讨PINK1/Parkin及NIX/BNIP3信号如何调控骨骼肌线粒体自噬，在运动对营养性肥胖模型的干预过程中影响如何。

已知肥胖机体细胞内氧化应激及线粒体生物发生异常，引发线粒体功能障碍，但在此过程中对线粒体自噬的影响鲜有报道。由于线粒体自噬属于机体逆向适应的新领域，目前关于运动与线粒体自噬的研究也相对较少，主要集中于药物刺激及基因修饰方面。Liu等研究发现ALCAT1 (A Lysocardiolipin Acyltransferase 1)缺失可上调PINK1的表达，增加线粒体自噬水平，缓解氧化应激，促进线粒体质量控制从而促进心肌细胞存活[31]。Kublin等认为，线粒体自噬是细胞内普遍存在的线粒体自我更新过程，线粒体受损可同时激活线粒体自噬及线粒体依赖的细胞凋亡，当应激程度处在细胞可抵御范围之内时，线粒体自噬启动且该过程先于细胞凋亡[28]。P53基因敲除及TIGAR (TP53-inducible glycolysis and apoptosis regulator)基因敲除小鼠心肌ROS含量明显增加，BNIP3表达上调促进线粒体自噬，而用抗氧化剂NAC (N-acetyl-cysteine)处理后，BNIP3活性适应性下调[23]。O’Leary等研究采用去神经手术模拟骨骼肌废用模型发现，小鼠骨骼肌质量下降，p62及Parkin向线粒体定位明显增加，提示骨骼肌废用引起线粒体受损，线粒体自噬应答机制启动，而可能后期降解机制受阻介导肌萎缩[36]。以上研究提示，氧化应激可能是线粒体自噬的先决信号，而运动训练又是引起适度氧化应激的手段，对研究运动、氧化应激及线粒体自噬的相互关系有一定指导意义。本研究结果显示，高脂膳食诱导的营养性肥胖小鼠模型中，其NIX mRNA有所下降，PINK1/Parkin信号无变化，而在运动干预过程中，PINK1、PARK2、PARL以及NIX、BNIP3 mRNA均适应性增加，而PINK1的蛋白表达水平在耐力运动与膳食改善后较高脂对照组增加约1倍，该结果提示，在运动改善营养性肥胖小鼠骨骼肌线粒体自噬过程中PINK1/Parkin及NIX/BNIP3信号的转录水平都发生适应性增加，而经典的PINK1/Parkin信号所介导的线粒体自噬则发挥主要作用，然而具体作用机制仍需要进一步研究。

综上，高脂膳食诱导的营养性肥胖小鼠骨骼肌线粒体自噬相关基因表达并无显著变化，提示肥胖机体线粒体功能障碍可能并非由线粒体自噬水平变化引起，而是与线粒体生物发生或融合、分裂异常有关。有趣的是，耐力训练引起的机体能量消耗增加促进骨骼肌线粒体自噬信号PINK1基因表达显著增加，可能是由于运动介导氧化应激是线粒体自噬的先决信号，促进线粒体更新及功能改善。

4 结论

长期高脂膳食干预可诱导营养性肥胖发生，导致机体代谢紊乱，骨骼肌线粒体功能异常。耐力运动结合膳食改善可有效控制营养性肥胖小鼠体重并促进肌球蛋白的表达。耐力运动结合膳食改善可缓解营养性肥胖机体细胞自噬水平的下降，而对线粒体自噬的影响主要通过作用于PINK1/Parkin信号以调控骨骼肌线粒体数量和功能。

[1]崔迪，贺杰，孙婧瑜，等.耐力训练与P53抑制剂PFT-α对小鼠骨骼肌线粒体自噬相关基因表达的影响[J].天津体育学院学报，2013，28(5):422-426.

[2]崔迪，邱守涛，漆正堂，等.Mieap与线粒体质量控制[J].中国运动医学杂志，2013，32(11):1029-1035.

[3]马国栋，刘艳环.耐力训练对急性酒精性肝损伤线粒体自噬功能的影响及机制研究[J].体育科学，2011，31(10):85-90.

[4]漆正堂，丁树哲.运动适应的细胞信号调控:线粒体的角色转换及其研究展望[J].体育科学，2013，33(7):65-69.

[5]孙志，张中成，刘志诚.营养性肥胖动物模型的实验研究[J].中国药理学通报，2002，18(4):466-467.

[6]ALERS S,LOFFLER A S,PAASCH F,etal.Atg13 and FIP200 act independently of Ulk1 and Ulk2 in autophagy induction[J].Autoph，2011,7(12):1423-1433.

[7]ASHRAFI G,SCHWARZ T L.The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria[J].Cell Death Differ，2013,20(1):31-42.

[8]DUVED C ,WATTIAUX R.Functions of lysosomes[J].Annu Rev Physiol，1966,28:435-492.

[9]DE MOURA M B,DOS SANTOS L S,Van HOUTEN B.Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer[J].Environ Mol Mutagen，2010,51(5):391-405.

[10]FISCHER F,HAMANN A,OSIEWACZ H D.Mitochondrial quality control:an integrated network of pathways[J].Trends Biochem Sci，2012,37(7):284-292.

[11]GANLEY I G,LAM DU H,WANG J,etal.ULK1.ATG13.FIP200 complex mediates mTOR signaling and is essential for autophagy[J].J Biol Chem，2009,284(18):12297-12305.

[12]GARBER K.Autophagy.Explaining exercise[J].Sci，2012,335(6066):281.

[13]GARNOL T,ENDLICHER R,KUCERA O,etal.Impairment of mitochondrial function of rat hepatocytes by high fat diet and oxidative stress[J].Physiol Res，2014,63(2):271-274.

[14]GOEDECKE J H,MICKLESFIELD L K.The effect of exercise on obesity,body fat distribution and risk for type 2 diabetes[J].Med Sport Sci，2014,60:82-93.

[15]GOLDSMITH J,LEVINE B,DEBNATH J.Autophagy and cancer metabolism[J].Methods Enzymol，2014,542:25-57.

[16]GREEN D R,LEVINE B.To be or not to be? How selective autophagy and cell death govern cell fate[J].Cell，2014,157(1):65-75.

[17]GREEN D R,Van HOUTEN B.SnapShot:Mitochondrial quality control[J].Cell，2011,147(4):950-951.

[18]GRUMATI P,COLETTO L,SCHIAVINATO A,etal.Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles[J].Autophagy，2011,7(12):1415-1423.

[19]GUO R,ZHANG Y,TURDI S,etal.Adiponectin knockout accentuates high fat diet-induced obesity and cardiac dysfunction:role of autophagy[J].Biochim Biophys Acta，2013,1832(8):1136-1148.

[20]HE C,BASSIK M C,MORESI V,etal.Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis[J].Nature，2012,481(7382):511-515.

[21]HE C,SUMPTER R J R,LEVINE B.Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain[J].Autoph，2012,8(10):1548-1551.

[22]HIROTA Y,KANG D,KANKI T.The physiological role of mitophagy:new insights into phosphorylation events[J].Int J Cell Biol，2012,2012:354914.

[23]HOSHINO A,MATOBA S,IWAI-KANAI E,etal.P53-TIGAR axis attenuates mitophagy to exacerbate cardiac damage after ischemia[J].J Mol Cell Cardiol，2012,52(1):175-184.

[24]HU C C,QING K,CHEN Y.Diet-induced changes in stearoyl-CoA desaturase 1 expression in obesity-prone and -resistant mice[J].Obes Res，2004,12(8):1264-1270.

[25]JAMART C,BENOIT N,RAYMACKERS J M,etal.Autophagy-related and autophagy-regulatory genes are induced in human muscle after ultraendurance exercise[J].Eur J Appl Physiol，2012,112(8):3173-3177.

[26]KABEYA Y,MIZUSHIMA N,YAMAMOTO A,etal.LC3,GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation[J].J Cell Sci，2004,117(13):2805-2812.

[27]KIM I,RODRIGUEZ-ENRIQUEZ S,LEMASTERS J J.Selective degradation of mitochondria by mitophagy[J].Arch Biochem Biophys，2007,462(2):245-253.

[28]KUBLI D A,GUSTAFSSON A B.Mitochondria and mitophagy:the yin and yang of cell death control[J].Circ Res，2012,111(9):1208-1221.

[29]LEE Y,KIM J H,HONG Y,etal.Prophylactic effects of swimming exercise on autophagy-induced muscle atrophy in diabetic rats[J].Lab Anim Res，2012,28(3):171-179.

[30]LEVINE B,KROEMER G.Autophagy in the pathogenesis of disease[J].Cell，2008,132(1):27-42.

[31]LIU X,YE B,MILLER S,etal.Ablation of ALCAT1 mitigates hypertrophic cardiomyopathy through effects on oxidative stress and mitophagy[J].Mol Cell Biol，2012,32(21):4493-4504.

[32]LOPEZ-MIRANDA J,PEREZ-MARTINEZ P,MARIN C,etal.Dietary fat,genes and insulin sensitivity[J].J Mol Med (Berl)，2007,85(3):213-226.

[33]LOWELL B B,SHULMAN G I.Mitochondrial dysfunction and type 2 diabetes[J].Sci，2005,307(5708):384-387.

[34]NAIR U,KLIONSKY D J.Activation of autophagy is required for muscle homeostasis during physical exercise[J].Autophagy，2011,7(12):1405-1406.

[35]NAKAMURA Y,KITAMURA N,SHINOGI D,etal.BNIP3 and NIX mediate Mieap-induced accumulation of lysosomal proteins within mitochondria[J].PLoS One，2012,7(1):e30767.

[36]O'LEARY M F,VAINSHTEIN A,IQBAL S,etal.Adaptive plasticity of autophagic proteins to denervation in aging skeletal muscle[J].Am J Physiol Cell Physiol，2013,304(5):C422-C430.

[37]RASMUSSEN H N,ANDERSEN A J,RASMUSSEN U F.Optimization of preparation of mitochondria from 25-100 mg skeletal muscle[J].Anal Biochem，1997,252(1):153-159.

[38]RUBINSZTEIN D C,MARINO G,KROEMER G.Autophagy and aging[J].Cell，2011,146(5):682-695.

[39]RUOHONEN S T,VAHATALO L H,SAVONTAUS E.Diet-induced obesity in mice overexpressing neuropeptide y in noradrenergic neurons[J].Int J Pept，2012,2012:452524.

[40]RUSSELL A P,FOLETTA V C,SNOW R J,etal.Skeletal muscle mitochondria:a major player in exercise,health and disease[J].Biochim Biophys Acta，2014,1840(4):1276-1284.

[41]SINGH K K.Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in aging and cancer[J].Ann N Y Acad Sci，2004,1019:260-264.

[42]SMUDER A J,KAVAZIS A N,MIN K,etal.Exercise protects against doxorubicin-induced markers of autophagy signaling in skeletal muscle[J].J Appl Physiol(1985)，2011,111(4):1190-1198.

[43]TANIDA I.Autophagosome formation and molecular mechanism of autophagy[J].Antioxid Redox Signal，2011,14(11):2201-2214.

[44]TONG J,YAN X,YU L.The late stage of autophagy:cellular events and molecular regulation[J].Protein Cell，2010,1(10):907-915.

[45]WHITWORTH A J,PALLANCK L J.The PINK1/Parkin pathway:a mitochondrial quality control system?[J].J Bioenerg Biomembr，2009,41(6):499-503.

[46]WIRAWAN E,VANDEN BERGHE T,LIPPENS S,etal.Autophagy:for better or for worse[J].Cell Res，2012,22(1):43-61.

[47]WOHLGEMUTH S E,SEO A Y,MARZETTI E,etal.Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging:effects of calorie restriction and life-long exercise[J].Exp Gerontol，2010,45(2):138-148.

[48]YOULE R J,NARENDRA D P.Mechanisms of mitophagy[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2011,12(1):9-14.

[49]ZHANG J,NEY P A.Role of BNIP3 and NIX in cell death,autophagy,and mitophagy[J].Cell Death Differ，2009,16(7):939-946.

TheEffectofEnduranceExerciseonAutophagyandMitophagyintheSkeletalMuscleofMicewithAlimentaryObesity

CUI Di,QIU Shou-tao,WANG Hai-yan,HE Jie,QI Zheng-tang,SUN Yi,DING Shu-zhe

Objective:To determine the effect of endurance exercise on cellular autophagy and mitophagy in skeletal muscle of obese mice and explore the underlying molecular mechanism.Methods:After the alimentary obesity ICR mice modle constrction,the obese mice were randomly divided into high-fat diet control group (HC,n=6),normal diet amelioration group (HN,n=6) and normal diet combined with endurance exercise group (HNE,n=6).The mice of normal diet control group during the constrction of alimentary obesity model were assigned as the normal control group (NC,n=6).The mice in groups NC,HN and HNE were fed with nomal diet while the mice of group HC were fed with high-fat diet .The mice of group HNE underwent treadmill running for 6 weeks,45min/d,6 times per week.Results:1) High-fat dier for 6 week increased the body weight,Lee’s index and epididymal fat percentage of mice,while a series of blood index such as BG,TG,TC,HDL-C and LDL-C increased significantly.2) The relative contents of myosin heavy chain Ⅰ,Ⅱa and Ⅱc mRNA were upregulated in group HNE,compared with group HC.3) The mitochondrial membrance potential of skeletal muscle in group HC was lower than that of group NC,while the mtDNA relative content in group HC,HN and HNE were lower than NC.4) Compared to NC,the autophagy related genes ATG13 and LC3 mRNA decreased while P62 mRNA expression level increased;the BECN1,ATG13 and LC3 mRNA relative content of HN and HNE were higher than those in HC (P<0.05) and the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰof HNE increased in skeletal muscle compared with HC.5) The mitophagy related gene NIX mRNA expression was lower in HC compared to that of NC,whereas it accerlarated in group HN and HNE;in group HNE,the PARK2 and PARL mRNA relative content increased compared to HN;the protein content of PINK1down-regulated in HC and up-regulated obviously in group HN and HNE(P<0.05).Conclusion:1) Long-term high-fat-diet intervention can lead to alimentary obesity accompanied with metabolic disorders and mitochondrial dysfunction in the skeletal muscle.2) Endurance exercise combined with dietary intervention can effectively slow down the weight gain and increase the protein expression of myosin heavy chain in the alimentarily obese mice.3) Endurance exercise combined with dietary intervention can obviously attenuate the decline of autophagy level induced by high-fat-diet as well as maintain the quality and function of mitochondria in skeletal muscle,in which the mitophagy related PINK1/Parkin singnaling pathway involves and plays a crititial role.

exercise;alimentaryobesity;autophagy;mitophagy;PINK1/Parkin

1000-677X(2014)12-0063-09

2014-07-14；

：2014-11-10

国家自然科学基金资助项目(31171142)；青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室建设项目(40500-541235-14203/004)。

崔迪(1987-)，女，河南博爱人，在读博士研究生，主要研究方向为运动适应与线粒体调控，E-mail：cuidi616@163.com；邱守涛(1986-)，男，山东济宁人，在读博士研究生，主要研究方向为运动对健康作用的分子机制研究；王海燕(1983-)，女，彝族，云南红河州人，在读博士研究生，主要研究方向为骨骼肌代谢与运动适应；贺杰(1977-)，女，河南南阳人，在读博士研究生，主要研究方向为运动适应与健康；漆正堂(1979-)，男，湖北黄冈人，高级工程师，博士，主要研究方向为线粒体运动适应与信号调控；孙易(1985-)，女，黑龙江哈尔滨人，讲师，博士，主要研究方向为运动对肥胖和Ⅱ型糖尿病的干预作用；丁树哲(1963-)，男，黑龙江哈尔滨人，教授，博士研究生导师，主要研究方向为运动适应与线粒体调控，Tel：(021)62235425，E-mail：szding@ied.ecnu.edu.cn。

华东师范大学 青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海 200241 Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention,Ministry of Education,East China Normal University,Shanghai 200241,China.

G804.7

：A