杜仲炮制前后绿原酸含量的毛细管区带电泳研究

张 英，王淑敏

(1. 内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059; 2. 长春中医药大学，吉林 长春 130117)

杜仲为杜仲科落叶乔木植物杜仲Ecommia ulmoides Olliv. 的树皮，所含绿原酸为主要成分[1]。目前，杜仲化学成分的分析方法主要有紫外可见分光光度法、高效液相色谱(HPLC)法、薄层色谱(TLC)法、纸层-紫外分光光度法等[2-4]，其中HPLC 法较常用。与HPLC 相比，毛细管电泳法具有分离速度快、分离效率高、样品及试剂消耗量少和毛细管柱寿命长且容易清洗等优点，近年来在中药有效成分分析中逐渐得到应用推广[5-6]。本试验中建立了测定杜仲中绿原酸含量的毛细管区带电泳(CZE)方法，并对炮制前后杜仲中绿原酸含量的变化规律进行了系统研究。现报道如下。

1 仪器与试药

Beckman Counter P/ACE MDQ Capillary Electrophoresis System高效毛细管电泳仪;弹性石英毛细管(75 μm×50 cm，河北永年光纤厂);pHS-3B 型酸度计(上海雷磁仪器厂)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110753-200212，供含量测定用);杜仲购于四川江柚药材公司，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为Ecommia ulmoides OLliv. 的干燥树皮;其他试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 测试条件

紫外检测波长327 nm;分离电压25 kV，静压力进样(高度10 cm，时间5 s);背景电解质为30 mmol/L 硼砂缓冲溶液(用0.2 mol/L醋酸和0.1 mol/L NaOH 调pH 至9.0)，使用前超声脱气10 min，毛细管使用前用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L硼砂缓冲溶液各清洗10 min，每次电泳后分别用0.1 mol/L NaOH、水和pH=9.0 的30 mmol/L 硼砂缓冲溶液清洗2，3，5 min。

2.2 溶液制备

称取绿原酸对照品0.48 mg，精密称定，置2 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取50，100，150，200，250 μL，置2 mL 容量瓶中，作为对照品溶液，使用前用0.45 μm 醋酸滤膜过滤;盐炮制品为杜仲生品用2%(g/g)盐水焖透后，在一定温度下烘干所得。取杜仲生品及盐炮制品(剪成均匀碎片)2 g，置锥形瓶中，精密称定，加50%甲醇溶液15 mL，精密称重，超声30 min，超声温度25 ℃，用50%甲醇补足质量，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 测定条件优化

缓冲溶液与溶液pH:考察了pH 为7.0 ～9.5 范围内pH 对电泳迁移的影响规律。结果表明，随着pH 的增加，两种分析物的迁移时间随之增加，分辨率也增加。可能是由于随着pH 的增加，电渗流和分析物电泳迁移速度虽同时增加，但两者方向相反，前者增加的程度大于后者的缘故。分别对对照品及实际样品进行了研究，结果表明，当pH≥9.0 时，能实现绿原酸的良好分离，因此确定pH=9.0 为最佳缓冲溶液的酸度。在10 ～50 mmol/L 范围内研究了缓冲溶液浓度对电泳分离的影响规律。结果表明，随着缓冲溶液浓度的增加，分析物的迁移时间增加，分离度提高。考虑到缓冲溶液浓度过高会使焦耳热效应明显，造成基线噪音增加，影响检测，故选择30 mmol/L 的硼砂缓冲溶液。

工作电压:在20 ～30 kV 范围内研究了工作电压的影响。结果表明，在20 ～30 kV 范围内，两种分析物峰高变化很小，两种分析物的迁移时间和分辨率均随着工作电压的升高而降低。同时，随着工作电压的升高，基线噪音增加，使检测灵敏度降低，当工作电压超过25 kV 后，这种影响变得明显。综合考虑分离度、峰高和灵敏度等因素，确定工作电压为25 kV。

进样时间:在3 ～8 s 范围内研究了进样时间的影响。结果表明，随着进样时间增加，分析物峰高、峰宽均增加。当进样时间超过5 s 后，峰高变化减慢，但峰展宽加剧，故确定进样时间为5 s。

有机溶剂:考察了缓冲溶液中乙腈含量对分离的影响规律。结果表明，随着缓冲溶液中乙腈浓度从5%到30%的增加，绿原酸的迁移时间呈增长趋势。这主要是因为有机溶剂乙腈的加入，使得电渗流降低;此外，有机溶剂的加入，提高了杜仲样品中某些化学成分的吸收。但当缓冲溶液中乙腈含量高于20%时，绿原酸的迁移时间达20 min 以上，对快速分析不利。因此，确定采用含有20%乙腈的缓冲溶液(即30 mmol/L 的硼砂+20%的乙腈)作为最佳分析条件。

2.3.2 线性范围、重复性和检出限试验

在上述优化的测定条件下，绿原酸在12 min 内能实现良好分离，分离的电泳图谱见图1。对分析物的线性关系进行了系统研究，结果表明，绿原酸质量浓度在0.06 ～0.30 g/L 范围内与峰面积呈良好线性关系，线性回归方程为 Y=84 795 X+689.3(r=0.999 4)。还对方法重复性进行了考察，结果绿原酸迁移时间和峰面积的RSD 分别为1.91%和2.30%(n=5)。利用3 倍噪音法，测得绿原酸的检出限为0.015 g/L。

2.3.3 加样回收试验

取杜仲生品适量，精密称定，准确加入一定量的绿原酸对照品，按供试品溶液制备待测溶液，依法进样测定，计算回收率。结果见表1，表明该方法用于杜仲的测定是准确、可靠的。

表1 绿原酸加样回收试验结果(n=5)

2.4 样品测定

利用所建立的方法，分析了杜仲生品和炮制品中绿原酸含量的变化情况，电泳图谱见图1B 和图1C。结果杜仲生品和炮制品中绿原酸含量分别为0.118%和0.130%(n=3)。可见，杜仲经盐水炮制后绿原酸含量增加了10.17%，这从化学成分方面对杜仲炮制后入药进行了科学的解释。

图1 毛细管区带电泳图

3 讨论

通过优化分离条件，建立了分析杜仲中绿原酸的毛细管区带电泳法，即电泳缓冲液为pH =9.0 的30 mmol /L 硼砂溶液加入20%乙腈的溶液，分离电压为25 kV，进样时间为5 s。实际样品分析及加样回收试验结果表明，该方法快速、准确、可靠，为杜仲药材和含有杜仲药材的药物的质量控制提供了有效的的分析方法。

利用所建立的方法对炮制前后杜仲中绿原酸含量进行分析，结果表明，杜仲经炮制后绿原酸含量明显增加，说明在炮制过程中杜仲的主要有效化学成分含量发生了变化。因此，杜仲炮制对其临床应用具有重要意义。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社，2010:365.

[2] 刘 慧，张 盛，刘仲华. HPLC 法同时测定杜仲皮中京尼平苷酸、绿原酸、京尼平苷和松脂醇二葡萄糖苷[J]. 中草药，2012，43(8):1 547 -1 549.

[3] 孙利伟，赵 辉，蔡楠楠. 正交试验优选杜仲中绿原酸的提取工艺[J]. 中国药业，2011，20(18):41 -43.

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