肱二头肌长头肌腱过度使用中相关生长因子蛋白表达规律的研究

高晓嶙，白云飞，王若晗，张晓兰

肱二头肌长头肌腱过度使用中相关生长因子蛋白表达规律的研究

高晓嶙1,2，白云飞3，王若晗2，张晓兰2

为研究生长因子在过度使用导致肌腱退行性变中的作用机制，利用SD大鼠8周下坡跑模型造成肱二头肌长头肌腱结节沟段退行性变，采用免疫组织化学等方法，检测运动各阶段肌腱IGF1、TGFβ1、 BMP12 、bFGF蛋白表达情况。 结果：在肱二头肌长头整体肌腱中，只有bFGF表达显著增加；bFGF在过度使用第2周显著升高(P<0.01)，第4周下降，第6周(P<0.05)和第8周(P<0.01)再次持续升高。在肱二头肌长头肌腱结节沟段，IGF1表达无显著变化，TGFβ1 、bFGF、 BMP12表达均显著增高；TGFβ1表达逐渐升高，第6周达到高峰(P<0.05)，第8周迅速下降；bFGF 表达在第4周迅速升高到峰值(P<0.01)，然后下降，到第8周与对照组无显著差异；BMP12蛋白表达逐渐增加，第6周达到高峰(P<0.05)，第8周略下降。结论：肌腱过度使用中相关生长因子蛋白长期异常表达是肌腱退行性变的重要病理变化，有可能推动了肌腱退行性变的进程。

过度使用；肌腱；退行性变；生长因子

生长因子在调节肌腱细胞功能，基质代谢，肌腱干细胞增殖、分化等方面具有重要的功能，在肌腱损伤修复、退行性变等病理过程中也具有重要作用。有研究[14,7]显示，肌腱退行性变组织中部分生长因子基因高表达，且肌腱细胞对生长因子反应异常，并据此推测在过度使用导致反复损伤积累过程中，肌腱组织有可能受到长期生长因子的异常作用，引起肌腱细胞功能异常，导致肌腱发生退变。本研究拟通过建立肌腱过度使用动物模型，检测相关细胞生长因子蛋白表达变化，综合探讨过度使用中相关细胞生长因子表达规律在肌腱退行性变中的作用机制，为揭示肌腱退行性变的病理机制提供相关实验依据和新思路。

1 研究材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠50只(维通利华公司提供)，两月龄，体重250.4±8.6 g。国家标准啮齿动物饲料喂养，自由饮食。饲养环境为室温18±2℃，光照时间12 h，相对湿度40%～55%。大鼠随机分为5组：对照组、2周组、4周组、6周组、8周组，每组10只SD大鼠。各组大鼠初始体重无显著性差异(P>0.05)。

1.2 运动方案

对照组大鼠笼中自由活动；2周组大鼠进行2周运动训练；4周组大鼠进行4周运动训练；6周组大鼠进行6周运动训练；8周组大鼠进行8周运动训练。采用跑台(中国杭州段式制作DSPY0202)建立下坡跑肱二头肌肌腱过度使用模型[2,6,16]。2、4、6、8周组大鼠先开始4天适应性训练(10°下坡跑，速度17～20 m/min，15 min/d)，然后开始正式训练(10°下坡跑，速度20～25 m/min，1.5 h/d，每周运动6天，休息1天)。

1.3 取材、切片与HE染色

对照组大鼠与8周组大鼠一起处死，取肌腱。2、4、6、8周组大鼠分别于最后一次运动结束24 h后处死，左侧取肱二头肌长头肌腱结节间沟部位，生理盐水冲洗，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，沿纵轴切片，厚度0.3 μm。苏木素伊红染色(HE)，光镜(10×20)观察肌腱损伤情况。右侧取肱二头肌长头肌腱全长，生理盐水冲洗，液氮固定，-70℃保存，以备ELASA和Westen blot检测用。1.4 免疫组化染色

采用免疫组化S-P法,第一抗体采用兔多克隆BMP12抗体(Ab92756)、兔多克隆bFGF抗体(Ab106245)、兔多克隆TGFβ1抗体(Ab31013)、兔多克隆IGF1抗体(Ab39398)。DAB显色，苏木素复染，阳性免疫复合物为棕色。光镜观察，放大倍数为400倍(10×40)。每个样本随机选3张切片，每张切片随机选择5个视野进行分析。

1.5 ELASA与Westen Blot

用滤纸吸干肱二头肌肌腱组织液和血液，称重肌腱组织，加入5倍PBS溶液，玻璃匀浆器匀浆3 min，置于冰上5 min，重复5次，至匀浆彻底。3 500 rpm离心10 min，取上清液。沉淀组织再次加5倍PBS溶液，玻璃匀浆器匀浆3 min，置于冰上5 min，重复5次，至匀浆彻底。3 500 rpm离心10 min，取上清液,合并两次上清液备用。采用Abcam公司ELASA试剂盒检测右侧肌腱bFGF、 TGFβ1、IGF1蛋白表达；Westen Blot法检测右侧肌腱BMP12蛋白表达，一抗为兔多克隆BMP12抗体(Ab92756)。

1.6 图像分析与统计学处理

采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件对免疫组化切片和Westen Blot电泳条带的平均光密度(MOD)值进行测定，以MOD值的变化反映蛋白表达量的相对变化。采用SPSS 19.0软件包进行数据分析，采用One-Way ANOVA方差分析总体蛋白表达差异，组间两两比较采用Bonferroni.法检验，结果均以平均数±标准差表示。P<0.05为显著性水平，P<0.01为非常显著性水平。

2 结果

2.1 肱二头肌长头肌腱结节间沟段组织病理

HE染色发现对照组肌腱结构正常，胶原纤维排列紧密、相互平行，着色正常；肌腱细胞核呈梭形或纺锤形，均匀排列在胶原纤维之间。从2周组开始出现胶原纤维结构和排列逐渐紊乱；4周组出现胶原纤维着色变浅或不均匀，部分肌腱细胞核向圆形转变，排列逐渐紊乱；6周组出现胶原纤维断裂，肌腱胶原纤维结构和排列更加紊乱，圆形细胞核比例增多，细胞外基质比例逐渐增多；8周组细胞分布更加不均，进一步出现局灶性细胞聚集。各组没有发现明显血管增生和透明样变性，也未见炎症细胞(图1)。

图 1 各组切片HE染色结果(200×)

2.2 生长因子蛋白表达

2.2.1 肱二头肌长头肌腱结节沟段

采用单因素方差分析检验对照组与各运动组的肱二头肌长头肌腱结节沟段生长因子蛋白表达的差异。结果发现，TGFβ1(P<0.05)、FGF(P<0.01)、BMP12(P<0.05)3个因子的蛋白表达有显著性差异。

IGF1蛋白表达的MOD在各组之间无显著性差异(P>0.05)；TGFβ1蛋白表达MOD值呈逐渐升高趋势，到第6周达到高峰，第8周出现显著下降；bFGF蛋白表达的MOD在第4周明显升高，之后又逐渐下降，第8周重新降到对照组水平。BMP12蛋白表达MOD逐渐增加，第6周升高明显，第8周又略有下降(图2)。

2.2.2 肱二头肌长头肌腱整体生长因子蛋白表达

采用单因素方差分析检验对照组与过度使用各组肱二头肌长头肌腱整体的生长因子蛋白表达的差异。结果发现，bFGF蛋白浓度在各组之间有显著性差异(P<0.01)。

表 1 本研究肱二头肌长头肌腱结节沟段生长

表 2 本研究各组肱二头肌长头肌腱结节沟部位生长因子蛋白表达(MOD)比较一览表

图 2 本研究过度使用中肱二头肌长头肌腱结

各组肌腱整体IGF1 、TGFβ1 和BMP12蛋白表达未发现显著性差异(P>0.05)。IGF1平均浓度在207.86～297.93 pg/ml之间；TGFβ1平均浓度在192.35～259.88

pg/ml之间。随着过度使用进行，第2周肌腱整体bFGF浓度出现显著升高，第4周下降，然后再次升高；2周组、8周组与对照组之间差异具有高度显著性(P<0.01)；6周组与对照组之间差异具有显著性(P<0.05)。bFGF平均浓度变化范围为91.41～134.23 pg/ml。

表 3 本研究肱二头肌长头肌腱整体生长

表 4 本研究各组肱二头肌长头肌腱整体生长因子蛋白表达比较一览表

3 讨论

目前，有关腱病中的病理特征已经确定[11]，主要为肌腱退行性变，如胶原纤维排列紊乱，失去正常的紧密平行排列的结构，甚至出现粘液样变性或透明样变性；腱细胞梭形外观消失，核变圆形，细胞外基质增多，可见局灶性细胞增多，没有炎症细胞；肌腱内可伴有不规则血管增生。本研究采用前人研究[2,6,16]建立的SD大鼠肱二头肌过度使用模型，切片显示，肱二头肌长头肌腱结节沟段从运动后第2周就出现了部分肌腱退行性变，如胶原纤维排列紊乱等，并且逐渐加重，相继发生胶原纤维淡染、细胞核变圆、细胞分布不均、纤维断裂等，结果证实肱二头肌过度使用模型建立成功。

肌腱具有很强的耐压、抗张力和抗摩擦的能力。力学刺激会对肌腱细胞表面的牵张受体和黏附位点产生很大作用，导致一系列生物效应的瀑布效应[4]。有研究[12]显示，周期性张力刺激可以提高许多生长因子表达，提示适宜的运动可以通过生长因子实现对肌腱的重塑。然而，在过度使用中是否也存在相关生长因子的高表达，其变化规律，是否在肌腱退行性变中发挥了作用还很少有报道。

本研究显示，过度使用过程中肱二头肌长头肌腱易损部位(结节沟段)与肌腱撕裂后愈合阶段的生长因子表达有明显区别。许多研究显示，肌腱断裂修复时多数生长因子表达升高相对较短，约在1周内。例如：Würgler-Hauri等人[18]利用大鼠岗上肌腱断裂修复术模型发现，bFGF、BMP12、BMP 13、BMP14、软骨寡聚基质蛋白(COMP)、结缔组织生长因子(CTGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)、TGFβ1在损伤后1周蛋白表达增高，然后迅速下降恢复到对照组水平。Heisterbach 等人[9]研究也发现，大鼠跟腱断裂后bFGF、 BMP12 和VEGF表达升高1周，然后bFGF、 BMP12迅速下降，而VEGF表达持续保持较高水平。陈亮等人[1]研究大鼠跟腱损伤部位修复过程中生长因子基因表达，发现IGF-1、bFGF、BMP12、TGFβ1等大部分生长因子在肌腱损伤早期(1周内)高表达，然后迅速下降。这些肌腱断裂修复研究结果表明，生长因子高表达在早期肌腱修复中起重要作用，但后期并不需要。本研究结果显示，过度使用过程中局部易损部位相关生长因子增高表达时间相对较长，大于2周，高峰期多数在第4～6周，且变化不一致，相对较乱。

从生理学来看，肌腱修复的相关生长因子作用复杂，且相互影响，对肌腱的生物学效应与剂量，细胞内外环境有密切关系，所以，长期高表达也许不一定有利于肌腱修复。例如，Nielsen研究[15]发现，长期过高/过低血浆IGF水平都会导致小鼠肌腱胶原纤维直径显著下降；Liu等人研究[13]发现，内源性IGF1和BMP2能促进PEG2诱导的肌腱干细胞脂肪分化；Bell等人[8]证实通过注射TGFβ1，可以造成跟腱退行性变化；Jiang等[10]研究结果提示，TGFβ1在腱病中I胶原合成与推动细胞凋亡上可能扮演重要角色；体外培养研究[5]显示，大剂量(30～50 μg/l)bFGF对肌腱细胞增殖和基因表达均有强烈抑制作用；Tang等人研究[17]还提示，bFGF的变化可能影响TGFβ1、血管内皮生长因子、结缔组织生长因子碱性螺旋-环-螺旋转录因子(scleraxis)、胰岛素样生长因子的表达。我们推测肌腱断裂修复时生长因子的协同变化可能促进了肌腱愈合过程，而过度使用中长期杂乱生长因子表达有可能不利于肌腱修复，甚至可能导致细胞功能紊乱、干细胞错误分化、基质代谢紊乱，推动肌腱退行性变的病理进程。

此外，本研究结果还显示，过度使用中肱二头肌长头肌腱整体与局部易损部位的生长因子表达规律不一致。肌腱整体只有bFGF蛋白表达显著增加，第2周显著升高，第4周下降，第6周和第8周再次显著升高；IGF1、TGFβ1、BMP12都没有显著性变化。结节沟段肌腱TGFβ1表达逐渐增高，到第6周最为显著，第8周有迅速下降；bFGF表达在第4周迅速升高到峰值，然后，又迅速下降，第8周与对照组无显著差异；BMP12蛋白表达逐渐增加，在第6周达到高峰，第8周又略有下降。IGF1在整个8周运动过程中都没有出现显著性变化。肱二头肌长头肌腱结节沟部位是临床腱病好发部位，长期承受着比周围肌腱更高的机械负荷刺激。本研究推测，正常情况下肌腱整体以bFGF 蛋白表达增高应对下坡跑运动，提高肌腱修复能力，而肌腱结节沟部位因为承受了长期过度的机械刺激量与强度，导致了更多生长因子长期高表达，肌腱在这种长期紊乱调节下，就可能会出现功能紊乱，向肌腱退行性变发展。肌腱整体与局部易损部位生长因子表达差异的结果提示：生长因子表达种类和出现顺序可能与承受的机械负荷大小有关，长期异常生长因子高表达与肌腱退行性变有关，可能推进了其病理进程。本研究还显示，IGF1蛋白表达在肌腱整体和易损部位都没有发生明显改变，提示并非所有的生长因子在肌腱过度使用中都会发生表达变化。其他一些大鼠肌腱研究也证实了这一点，如李敏等[3]在大鼠急性跑台运动后检测跟腱中IGF1基因、蛋白表达，也未发现有明显变化；Molloy等[14]检测了大鼠岗上肌腱过度使用肌腱基因表达谱，同样没有发现IGF1基因表达出现上调/下调变化。

4 小结

在肌腱过度使用中，肱二头肌长头肌腱整体与局部易损部位的生长因子蛋白表达规律不一致；局部易损部位相关生长因子蛋白表达变化较乱，并非所有生长因子都出现变化，与肌腱断裂修复有明显区别；肌腱过度使用中相关生长因子蛋白长期异常表达是肌腱退行性变的重要病理变化，有可能推动了肌腱退行性变的进程。

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StudyonGrowthFactorsProteinExpressionCharacteristicsinTendonofLongHeadofBicepsBrachiiduringOveruseProcess

GAO Xiao-lin1,2,BAI Yun-fei3,WANG Ruo-han2,ZHANG Xiao-lan2

Objective:This experlment was dessgned to study the role of growth factors in tendon degeneration overuse-induced.Methods:This study established the rats tendon overused model by downhill running,detected growth factors gene expression in various stages of overuse by immunohistochemistry.Results:In whole tendon,bFGF protein expression was significantly increased during the downhill running,but TGFβ1,bFGF and BMP12 had no significantly change.bFGF was significantly increased at 2 weeks (P<0.01),decreased at 4 weeks,and raised again at 6-8 weeks.In rat biceps brachii tendon intertubercular sulcus parts,IGF1 expression had no significantly change,but expression of TGF β1,bFGF,and BMP12 were significantly increased.The expression of TGF β1 increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),decreased rapidly at 8weeks.The expression of bFGF reached the peak at 4 weeks value (P<0.01),and then decreased at 8 weeks.The expression of BMP12 protein increased gradually,reached a peak at 6 weeks (P<0.05),and declined slightly at 8 weeks.Conclusion:During overuse process,long-term abnormal expression of growth factors was an important pathological chang of tendon degeneration,which probably pushed the tendon degeneration process.

overuse;tendon;degeneration;growthfactor

1000-677X(2014)09-0044-05

2014-03-20；

：2014-08-06

高晓嶙(1974-)，男，安徽人，副研究员，博士，研究方向为运动损伤预防与康复，Tel：(010)87182525，E-mail：gao321452@sina.com。

1.国家体育总局体育科学研究所，北京 100061；2. 北京体育大学，北京100084；3.国家体育总局运动医学研究所 体育医院，北京 100061 1.China Institute of Sport Science,Beijing 100061，China;2.Beijing Sports University,Beijing 100084.China;3.National Research Institute of Sports Medicine,Beijing 100061,China.

G804.7

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