运动预适应保护效应中大鼠心肌B型钠尿肽表达的变化

刘泽广，潘珊珊，郝 喆，陆 矫，苑建齐

运动预适应保护效应中大鼠心肌B型钠尿肽表达的变化

刘泽广，潘珊珊，郝 喆，陆 矫，苑建齐

目的：探讨运动预适应(EP)对心肌BNP表达变化的影响以及在运动预适应保护效应期间BNP是否发挥了保护效应。方法：SD大鼠分为对照组(C组)、大强度运动组(HE组)、早期运动预适应组(EEP组)、晚期运动预适应组(LEP组)、早期运动预适应+大强度运动组(EEP+HE组)、晚期运动预适应+大强度运动组(LEP+HE组)。在EP动物模型基础上，通过大强度运动致大鼠运动性心肌损伤。用免疫化学发光法检测血浆cTnI含量，HE染色、HBFP染色法和变色酸2R-亮绿染色法检测心肌形态及缺血缺氧改变。分别通过免疫组织化学法和酶联免疫吸附法检测心肌组织和血浆中的BNP表达变化。结果：与C组相比，HE组cTnI和缺血缺氧水平显著升高，而EEP组和LEP组无显著差异；HE组、EEP组和LEP组心肌组织BNP均呈显著性升高，而血浆BNP仅HE组和EEP组有显著性升高，LEP组却无明显差异。与HE组相比，EEP+HE组和LEP+HE组cTnI和缺血缺氧水平明显下降，心肌组织BNP均呈显著性升高，而血浆BNP仅LEP+HE组有显著升高，EEP+HE组无显著性差异。结论：EP可有效促进心肌分泌BNP，且BNP参与了EP对运动性心肌损伤的保护效应。

B型钠尿肽;运动预适应;心肌保护效应;心肌损伤;大鼠

B型钠尿肽(B-type natriuretic peptide，BNP)，是钠尿肽家族中的一员，1988年首次在猪脑中被发现[36]，是一种含有23个氨基酸的多肽，主要来源于左心室[24,25]。研究表明，BNP的表达量与心肌机械张力、神经激素调节系统以及心动过速等因素有关[38]。BNP在心房及心室的储存量都较少，因此，当心肌受到刺激时，BNP呈爆发式合成以实现快速分泌。BNP与心钠素的功能相似，具有利尿、利钠和抗醛固酮的作用，可以达到缓解心肌前负荷及后负荷的效果[11]，以增加心搏出量。在临床方面，BNP对心衰的治疗和诊断作用受到了日益的重视,一种重组的B型钠尿肽药物在治疗失代偿心衰方面表现出了显著的疗效[8,12]。另外，BNP是诊断心衰较为敏感的标志物[1,9]，并且对心衰具有较强的预后价值[27]。

近年来，运动预适应的保护效应不断被人们所熟知，反复短暂的间歇性大强度运动可造成心肌反复短暂的相对缺血缺氧，通过运动诱导机体产生内源性心肌保护效应的方式称之为运动预适应(exercise preconditioning，EP)[29,34]。EP的心肌保护效应分为两个时间窗：运动结束后即刻产生，持续1～3 h的早期保护效应；运动结束24 h后产生，持续24～72 h的晚期保护效应。在EP保护效应的细胞信号转导通路中主要涉及触发物质、中介物质和效应物质，在本课题组前期的工作中，已对中介物质中的蛋白激酶C[2]、效应物质中的ATP敏感钾离子通道、降钙素基因相关肽等[6,7]物质进行了研究，但触发物质中的BNP在EP保护效应中的表达变化如何，尚待进一步的研究。在运动过程中，由于交感神经活动的增强，血压升高，心率加快，室内充盈压上升，从而促进了BNP的合成和分泌。有研究表明，长期剧烈运动可显著提高血浆BNP的浓度[28]。随着研究的不断深入，人们发现一次短时间运动也可以有效促进BNP的分泌[15,21,32]。据此，本研究假设EP这种运动方式可以促进心肌产生BNP，并且在随后心肌耐受长时间缺血缺氧的过程中发挥效能。因此，我们在EP动物模型的基础上，用一次长时间大强度运动致大鼠运动性心肌损伤，采用血浆cTnI检测及HE、缺血缺氧染色法综合评价运动对心肌的损伤情况；分别通过免疫组织化学法和酶联免疫吸附法检测心肌组织和血浆中的BNP表达变化，以探讨EP是否可以有效的促进心肌分泌BNP，并且，在EP保护效应中是否发挥了重要作用，为EP心肌保护效应与机制提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠150只，体重237±18 g(购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司)。大鼠常规分笼饲养，5只/笼，均以标准啮齿类动物饲料喂养(购自第二军医大学实验动物中心)，自由饮食。室温20℃～22℃，相对湿度45%～50%，光照时间为12 h/d。大鼠适应性喂养一周，期间进行3天的适应性训练：大鼠进行跑台运动，速度为15 m/min，运动10 min。在适应性训练结束后，将大鼠体重分层，进行随机分组。总共分为6组：对照组(control group，C组)、大强度运动组(high-intensity exercise group，HE组)、早期运动预适应组(early exercise preconditioning group,EEP组)、晚期运动预适应组(late exercise preconditioning group,LEP组)、早期运动预适应+大强度运动组(early exercise preconditioning plus high-intensity exercise group,EEP+HE组)、晚期运动预适应+大强度运动组(late exercise preconditioning plus high-intensity exercise group,LEP+HE组)。

1.2 动物模型建立

1.3 动物取材

大鼠腹腔采用10%水合氯醛以40 mg/100 g的剂量进行麻醉，后将大鼠仰卧位固定于手术台上，打开腹腔，下腔静脉取血5 ml后，静置15～30 min，离心取血浆，-80℃保存，用于血浆cTnI和血浆BNP的检测。每组大鼠随机抽取12只，打开大鼠胸腔，暴露心脏，于大鼠心尖下插入灌注针，灌注0.85%生理盐水250 ml～300 ml，并注入1%肝素抗凝，剪断大鼠下腔静脉，待流出液体基本无色后，灌注4%多聚甲醛250 ml～300 ml，整个过程在30 min内完成。取出心脏，4%多聚甲醛中后固定24 h。常规梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，用于心肌HE、缺血缺氧染色和BNP免疫组织化学实验。

1.4 血浆cTnI含量检测

用免疫化学发光法(Chemiluminescent Immunoassay)测定血浆cTnI的含量。采用单克隆抗体试剂(碱性磷酸酶标记)，以磁微粒为固相载体，Dioxetane磷酸酯(碱性磷酸酶的底物)为发光剂，超灵敏光电倍增管接受抗体-抗原反应激发的发光信号。仪器为Beckman Coulter公司生产的Access 2 immunoassay system(全自动化学发光免疫测定系统)。试剂由仪器生产厂家配套供应，线性范围为0.01～99.99 ng/ml。

1.5 心肌组织HE及缺血缺氧染色实验

三种染色方法均先将石蜡切片进行常规脱蜡至水，苏木精染色。HE染色通过伊红浸染，观察心肌组织形态改变；苏木素-碱性复红-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid，HBFP)染色法：在0.1%碱性复红浸染3 min，去离子水冲洗后，先在丙酮Ⅰ浸洗5 s，后在0.1%苦味酸丙酮中浸染15～20 s，再入丙酮Ⅱ浸洗5 s；变色酸2R-亮绿(chromotrope 2R-brilliantgreen，C-2R)染色法：入变色酸2R液浸染10 min，后用0.2%冰醋酸水溶液冲洗2～3次，再浸入含有0.5%亮绿的20%酒精溶液中10 min。所有切片染色过后，均进行脱水、透明、封片，制成相应染色切片。

1.6 血浆BNP含量检测

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血浆BNP含量。测定前将试剂盒放置室温40 min，分别设定空白孔、待测样品孔、标准孔，空白对照孔不加样本；待测样品孔加入样本40 μl；标准品孔加入不同浓度的标准品50 μl，然后各加入抗-BNP抗体10 μl，链酶亲和素-HRP 50 μl。盖上封板膜后，37℃温育60 min。洗涤后每孔先加入显色剂A 50 μl，再加入显色剂B 50 μl，37℃避光反应10 min。每孔加终止剂50 μl，终止反应。根据制备的标准曲线，计算样本含量。

1.7 心肌组织BNP免疫组织化学实验

采用免疫组织化学SABC法进行BNP免疫组织化学检测。制作常规石蜡切片，切片脱蜡至水；3%过氧化氢室温10 min；滴加复合消化液10 min；室温血清封闭20 min；滴加一抗(兔抗鼠1∶100，博奥森公司)4℃湿盒内孵育过夜；滴加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG，武汉博士德公司)湿盒孵育20 min；滴加SABC试剂37℃湿盒内孵育20 min；DAB室温显色；苏木精复染；常规脱水透明封片；用PBS代替一抗，并以相邻切片做阴性对照。

1.8 组织学图像处理

HBFP染色、C-2R染色和BNP免疫组织化学结果在Olympus显微镜下观察并进行图像采集。每个实验组随机选取5张组织切片，每张切片随机采集5个视野(×400)，每组切片共测25个视野。应用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0对每个视野进行图像分析，测定每个视野的阳性表达面积和积分光密度(Integral Optical Density，IOD)。

1.9 数据统计与分析

2 结果

2.1 大鼠血浆cTnI含量

与C组相比，HE组血浆cTnI浓度水平明显升高，具有显著性差异(P<0.05)；而EEP组、LEP组则无较大变化，差异不具有显著性。与HE组相比，EEP+HE组和LEP+HE组大鼠血浆cTnI浓度水平明显偏低，具有显著性差异(P<0.05)。EEP组与LEP组相比、EEP+HE组和LEP+HE组相比，差异不具显著性(表1)。

表 1 本研究大鼠血浆cTnI水平变化一览表

2.2 大鼠心肌组织HE、缺血缺氧染色和图像分析

C组与EEP组、LEP组大鼠心肌纤维形态结构正常，着色均匀，细胞排列紧密整齐；细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，略见横纹(图1-A、图1-B、图1-C)。HE组大鼠心肌纤维可见形态异常，着色不均匀，细胞边界模糊不清，细胞排列不整齐(图1-D)。EEP+HE组、LEP+HE组大鼠心肌纤维无明显形态结构改变，但存在少量空泡，细胞排列间隙增大(图1-E、图1-F)。

正常心肌组织经HBFP染色及C-2R染色后分别呈黄色和绿色，细胞核呈蓝黑色；缺血缺氧心肌组织呈红色。C组细胞胞浆分别呈黄色和绿色，蓝紫色细胞核位于细胞中央，细胞排列规则，两种染色均未见明显鲜红色缺血缺氧染色结果(图2-A1、图2-B1)。HE组细胞界限模糊，在两种染色中均出现大面积片状鲜红色染色(图2-A4、图2-B4)。EEP组与LEP组细胞界限清晰，两种染色结果相一致，均仅有少量斑块状鲜红色染色(图2-A2、图2-A3、图2-B2、图2-B3)。在HBFP染色中，EEP+HE组仅有少量鲜红色染色(图2-A5)；LEP+HE组细胞结构基本完整，出现一定量的鲜红色染色(图2-A6),并且C-2R染色结果与HBFP染色结果相一致(图2-B5、图2-B6)。

图 1 本研究大鼠心肌组织切片HE染色结果 ×400

在图像分析结果中，HBFP染色与C-2R染色所显示的结果意义相一致。与C组相比，EEP组和LEP组缺血缺氧面积和IOD无显著性差异，而HE组显著增加，差异具有显著性；与HE组相比，EEP+HE组和LEP+HE组缺血缺氧面积和IOD均显著减少(P<0.05)；EEP组与LEP组相比、EEP+HE组与LEP+HE相比，缺血缺氧面积和IOD均无显著性差异(P<0.05,表2)。

图 2 本研究大鼠心肌组织切片缺血缺氧染色结果 ×400

表 2 本研究大鼠心肌组织缺血缺氧染色结果图像分析一览表

2.3 大鼠血浆BNP含量

图 3 本研究大鼠血浆BNP水平变化柱状图

与C组相比，HE组、EEP组血浆BNP浓度水平明显升高，具有显著性差异(P<0.05)；而LEP组则无显著性变化。与HE组相比，LEP+HE组大鼠血浆BNP浓度水平明显升高，具有显著性差异(P<0.05)；但EEP+HE却无显著性变化。与LEP组相比，EEP组血浆BNP显著上升(P<0.05)。与LEP+HE组相比，EEP+HE组血浆BNP显著性下降(P<0.05,图3)。

2.4 大鼠心肌组织BNP免疫组织化学观察

通过免疫组织化学实验后，BNP免疫阳性反应呈棕褐色，细胞核由苏木精染为蓝紫色。C组心肌组织BNP阳性表达极少，蓝紫色细胞核散乱分布在细胞中央及细胞间隙(图4-A)；HE组心肌组织BNP阳性表达明显增强，阳性反应呈块状无序分布于胞浆内(图4-B)；EEP组和LEP组免疫阳性反应区域较多，但不如HE组表达明显(图4-C、图4-D)；EEP+HE组和LEP+HE组BNP阳性反应呈片状或块状大量分布于心肌组织中，阳性反应颜色较深(图4-E、图4-F)，在所对应的阴性相邻切片中，用PBS代替一抗，切片中并未出现BNP阳性反应。

图 4 本研究大鼠心肌组织

BNP免疫阳性反应图像分析结果显示，与C组相比，HE组、EEP组和LEP组阳性反应面积增加，IOD增强，差异具有显著性(P<0.05)；与HE组相比，EEP+HE组与LEP+HE组免疫阳性面积增加，IOD增强，差异具有显著性(P<0.05)。EEP组与LEP组相比，免疫阳性面积和IOD均无显著性差异。EEP+HE组的免疫阳性面积和IOD要比LEP+HE组高，差异具有显著性。(P<0.05，图5、图6)。

图 5 本研究大鼠心肌组织BNP免疫反应面积柱状图

3 讨论

3.1 BNP生物学特性

心肌产生结构相关的肽类激素家族，称之为钠尿肽家族，其主要成员有心钠素、B型钠尿肽和C型钠尿肽。BNP广泛分布于脑、脊髓、心、肺等组织，但其中以心脏含量最高。人体BNP的分子结构和其他钠尿肽家族成员一样，都含有一个由17个氨基酸构成的环状结构，此环状结构由两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接而成，在不同钠尿肽之间具有高度同源性，并且，此结构被认为是钠尿肽生物活性和介导与受体结合的核心因素[33]。与心钠素相比，BNP在心肌特殊颗粒中储存量极少，但当心肌受到刺激时，BNP呈爆发式快速合成，所以BNP的调控主要基于细胞的基因转录水平。研究表明，多种因素可促进BNP基因的转录，例如机械张力、心肌缺血缺氧、内皮素和血管紧张素Ⅱ等[22]。当心肌受到刺激后，首先，BNP基因编码出含有134个氨基酸的Prepro-BNP，在内质网内快速切去含有26个氨基酸的信号肽后成为proBNP，之后，进一步被激素原转化酶切割为具有生物活性的BNP和不具有生物活性的NT-proBNP。BNP发挥其生理作用需要与其受体相结合，钠尿肽家族主要有3型受体，其中，BNP主要与受体A结合发挥效用，而受体A主要分布在心脏、大血管及肾脏。当BNP与受体结合后，cGMP被激活增多，作为第二信使激活下游信号通路，通过介导离子通道、蛋白激酶和磷酸二酯酶等发挥BNP的生物效能。BNP不但可以抗交感神经兴奋，还被认为是肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统的天然拮抗剂，因此BNP具有舒张血管以及利尿、利钠的作用，从而调节体内水盐的动态平衡，以达到缓解心脏负荷的作用。鉴于BNP如此强大的生理作用，BNP已作为药物治疗应用于临床[12]，并且其综合效用要优于硝酸甘油[30]。

图 6 本研究大鼠心肌组织BNP免疫反应IOD值柱状图

3.2 运动预适应诱导心肌保护效应

Murry等人于1986年发现缺血预适应(ischemic preconditioning，IP)现象，即反复短时间的心肌缺血/再灌注可以使心肌耐受随后更长时间的缺血[26]。IP是一种强有力的内源性心肌保护效应。随着对IP的不断深入研究，人们发现运动、低氧、高温、快速起搏和药物等方式也可以诱导IP样保护效应。目前运动预适应、低氧预适应等已成为运动心脏保护的研究热点。Domenech等人在实验中让狗以6 km/h的速度进行跑台运动，运动5 min，休息5 min，如此重复5次，在运动结束后即刻和24 h时，结扎冠脉前降支1 h，发现心肌梗死面积分别减小了78%和46%[13]。提示EP可以有效的减少梗死面积，且其保护效应期分为早期保护效应和晚期保护效应。本课题组[10]前期的研究结果表明，大鼠在28～30 m/min的跑台速度下，进行连续3天的跑台运动，每天运动60 min，其中运动15 min，休息5 min，重复3次，EP可以有效的减少心肌缺血缺氧的面积，提示EP可以成功诱导出心肌保护效应。其中对EP机制中的多种物质进行了系统的研究[2,6,7]，但还未涉及心脏内分泌相关物质。据此本实验EP动物模型诱导其保护效应，从而探讨EP及其保护效应中BNP的水平变化及其作用机制。

本实验采用HE、缺血缺氧染色及血浆cTnI检测的方法，从组织和血液两个方面综合评价运动致心肌损伤的程度。HE染色是组织形态基本的观察方法；HBFP染色是检测早期心肌缺血缺氧较为敏感的方法之一，当心肌缺血缺氧时，会分泌一种蛋白-磷脂复合物，与碱性复红相结合，从而将缺血缺氧细胞染成鲜红色；C-2R染色根据缺血缺氧细胞和正常细胞对不同色素的着色程度不同，而成为心肌特异性缺血缺氧染色。此两种染色方法不但可以有效的评价心肌损伤情况，还可以清楚的标记心肌组织的损伤区域，以及细胞损伤后的结构变化，通过图片对比，可较为直观地观察到细胞损伤的变化。cTnI作为心脏损伤标志物已经应用于临床多年。心肌细胞中大量cTnI位于肌球蛋白的细肌丝上，当心肌受到损伤时，胞质中的游离cTnI首先透过细胞膜进入血液，随着心肌损伤的不断加深，大量cTnI从肌原纤维上裂解下来。由于其高度的心肌特异性、心肌损伤高敏感性以及较长的窗口期，使其成为诊断心肌损伤、心肌梗死的“金标准”[4]。与此同时，cTnI也是评价EP动物模型的常用指标[2]。缺血缺氧染色和血浆cTnI这两种评价方式相比较，cTnI检测特异性更高，而缺血缺氧染色可将损伤细胞定位，并进行半定量统计。本课题组前期研究曾采用cTnI检测和HBFP染色作为心肌损伤的评价指标，并能够较好的评价EP保护效应及运动损伤[10,34,35]，此次实验配合HE、C-2R染色更能较为全面的综合评价运动心肌损伤。实验结果显示，与C组相比，EEP组、LEP组缺血缺氧面积及IOD以及血浆cTnI均无显著性变化，进一步证实EP是一种无损伤性预适应方式[2,10,34]；HE组缺血缺氧面积、IOD和血浆cTnI均显著提高，提示大强度运动导致心肌造成较大损伤。与HE组相比，EEP+HE组和LEP+HE组心肌缺血缺氧面积、IOD以及血浆cTnI均有明显下降，差异具有显著性。提示EP所诱导的内源性心肌保护效应在心肌遭受损伤时发挥了保护作用。与LEP+HE组相比，EEP+HE组血浆cTnI和缺血缺氧染色结果虽无显著性差异，但却有下降的趋势，提示在本次实验中EP保护效应的早期效果和晚期效果无显著性差异，但具有早期保护效果较晚期保护效果更为明显的趋势。

3.3 运动预适应促进心肌BNP的分泌及其可能机制

BNP的含量不但与心室压力、神经激素调节系统有关，还与年龄、生理周期及运动有关。Ohba H等人发现，在一次100 km超长距离马拉松过后，人体血浆BNP含量显著上升[28]。国内相关报道显示，大鼠跑台耐力运动11周后，心室BNPmRNA表达显著上升[5]。随着研究的不断深入，短暂大强度运动也可以导致BNP含量的上升。有学者对伴有冠状动脉疾病的患者进行布鲁斯运动试验，平均运动时间为5～7 min，运动后即刻，血浆BNP含量较运动前有显著性提升[15，32]。Huang[19]等人和Krupicka[21]等人也通过运动试验及其他负荷递增的运动方式证实健康人群中，在短时间大强度运动后，人体BNP含量会急剧升高。因此，心脏病患者及健康人群，运动后BNP水平均会升高。在本实验的结果中，与C组相比，HE组大鼠心肌组织BNP和血浆BNP含量都发生显著性上升，提示一次长时间大强度运动可促进BNP的分泌水平，这与其他学者研究结果相一致。EEP组和LEP组大鼠的免疫组织化学结果显示，这两组BNP含量无显著性差异，但与C组相比，这两组均发生了显著性上升。但血浆BNP结果却有所不同，EEP组BNP水平显著高于LEP组；与C组相比，仅EEP组发生了显著性上升，而LEP组虽有上升趋势，但差异却不具有显著性。这可能是由于BNP在血浆中的半衰期较短而导致的，在EP结束后的24 h中，血浆中的BNP在经过神经内切酶的降解以及与受体C的结合后，血液中的BNP水平逐渐恢复到正常水平，因此，LEP组中血浆BNP含量较少。EEP组和LEP组BNP免疫组织化学和血浆结果，提示除一次短暂大强度运动可以提升BNP含量外，EP这种运动方式也可以显著有效的促进心肌BNP的分泌水平。

EP诱导心肌组织产生BNP的机制可能与心肌机械张力及神经激素系统有关。在心肌致密颗粒中不含有BNP，因此，BNP的调节主要发生在基因水平。影响BNP转录启动因子的途径主要涉及GATA、AP-1和M-CAT这三条信号传导通路，其中GATA起到重要作用。有研究表明，在机械张力作用下，激活p38 MAPK信号通路，从而提高GATA-4的活性，进而提高BNP基因的表达，这可能是BNP表达的一种机制[20]。也有研究表明，增加心脏压力负荷或室壁张力，可以显著上调GATA-4和BNPmRMA的表达，但内皮素受体阻断剂可以抑制这种表达，表明ET-1(内皮素-1)可能参与了GATA-4的调控[17,18]。提示BNP转录的另一条分子通路可能是，神经激素ET-1上调GATA-4活性，从而加强BNP的转录水平。在EP过程中，间歇性短暂大强度运动使得大鼠心率上升，心室壁张力增加，心脏负荷过重，引起ET-1的过量表达，在与机械张力的双重刺激下，GATA-4活性增强，从而激活BNP转录启动因子，进而调控了BNP的转录表达。

3.4 运动预适应保护效应中BNP的保护作用及其可能机制

BNP是钠尿肽家族控制血压和体液平衡的重要成员之一，它持续不断的分泌以适应、缓解心室容积扩张和压力负荷的增加。BNP可以调节血压，减少体循环和肺循环的血管阻力，降低全身动脉血压和静脉回流，同时，还具有利尿、利钠、抑制缩血管活性肽产生的作用[23]。有研究表明，将大鼠左冠状动脉结扎30 min再灌120 min，在缺血/再灌注前10 min进行BNP静脉注射，可有效抑制心肌梗塞面积[14]。另有研究表明，不管是培养的心肌细胞还是在体的大鼠心肌，在缺血/再灌注的过程中进行BNP干预，都可有效减少心肌因缺血/再灌注所导致的细胞凋亡或心肌梗塞[31,37]。本实验结果中，在EP诱导的早期和晚期保护效应中进行大强度运动，BNP免疫组化结果显示，在组织中，EEP+HE组BNP水平要显著高于LEP+HE组；但在血浆中，EEP+HE组BNP水平要显著低于LEP+HE组。导致这一结果不一致的原因可能是，在EP保护效应的早期，BNP主要保留在组织中，这在心肌遭受缺血缺氧时可以更好的起到保护效应；在EP保护效应的晚期，虽然EP诱导的BNP在血浆中已恢复到正常水平，但EP所诱导的BNP启动因子仍处于高位，一旦受到大强度运动的刺激，BNP即可快速达到较高水平。与HE组相比，EEP+HE组和LEP+HE组大鼠心肌组织BNP表达均显著上升，而HBFP染色结果和血浆cTnI结果显示这两组大鼠心肌并未发生显著性损伤，提示在EP所诱导的心肌保护效应中，BNP发挥了保护作用。在血浆BNP结果中，与HE组相比，LEP+HE组的BNP表达水平显著性升高，血浆结果与免疫组织化学结果相一致；但EEP+HE组却无显著性变化，可能的原因是在EP保护效应的早期，心肌BNP以自分泌为主，因此入血较少，组织中EEP+HE组BNP水平高于LEP+HE组，也间接证实了这种可能。EEP+HE组和LEP+HE组BNP免疫组织化学和血浆结果，提示在EP保护效应中，BNP发挥了保护心肌的作用。

BNP发挥其生理作用主要是通过与受体相结合的方式实现的。当BNP分泌入血与受体结合后，激活鸟苷酸环化酶活性，从而促进鸟苷三磷酸转化为环磷酸尿苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)。cGMP具有强大的舒张血管作用，可以介导蛋白激酶以及离子通道等发挥BNP的生物活性。有研究表明，对心肌细胞进行缺血缺氧处理，加入BNP的心肌细胞死亡率显著降低，但加入蛋白激酶G抑制剂后，这种BNP的保护作用被废除[16]。另有研究表明，对猪心左前降支血管进行BNP处理，其血管环产生了明显的舒张效应，但分别加入鸟苷酸环化酶抑制剂和ATP敏感钾离子通道抑制剂后，BNP的血管舒张作用均发生明显下降[3]。以上研究结果提示，在BNP发挥其效用的过程中，蛋白激酶G、鸟苷酸环化酶以及ATP敏感钾离子通道均发挥了重要作用。通过EP促进心肌BNP表达上升，在心肌遭受损伤时，BNP与心肌组织中的受体相结合，激活cGMP活性，进而舒张冠状动脉及外周血管，减轻心脏后负荷，促进血液循环，以达到缓解心肌缺血缺氧的保护作用；同时，进入血液的BNP通过循环系统与肾脏中的受体相结合，可增加肾小球的滤过面积和有效滤过率，减少集合管对钠的重吸收和转运，进而达到利尿、利钠的作用，降低静脉回流，减轻心脏前负荷，降低心肌耗氧量。

4 结论

EP是一种无损伤性预适应方式，对大强度运动导致的运动性心肌损伤起到保护作用。早期运动预适应和晚期运动预适应均可以促进心肌分泌BNP，但BNP分泌水平的变化在两者之间无明显差异。BNP参与了EP对运动性心肌损伤的保护作用，在早期保护效应和晚期保护效应中均发挥了重要作用。

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ChangeofB-typeNatriureticPeptideExpressionduringExercisePreconditioningInducedMyocardialProtectioninRat

LIU Ze-guang,PAN Shan-shan,HAO Zhe,LU Jiao,YUAN Jian-qi

Objective:To view the change of B-type natriuretic peptide (BNP) expression during exercise preconditioning and determine whether BNP participated incardioprotective effect of exercise preconditioning.Methods:SD rats were divided into control group (C),HE group,EEP group,LEP group,EEP+HE group,and LEP+HE group.After establishing of EP animal model,high-intensity exercise on treadmill for inducing myocardial injury.Then the lever of cTnI was detected by chemiluminescent immunoassay.HE staining was used to observe the changes in ventricular structure.Hematoxylin-basic-fuchsin-picric acid (HBFP) staining and Chromotrope 2R-brilliant green (C-2R) staining were evaluated the degree of myocardial ischemia/hypoxia.The change of BNP in myocardium and plasma were detected by immunohistoChemistry and enzyme inked immunosorbent assay respectively.Results:As compared with the group C,there was no significant difference in the level of cTnI and the degree of myocardial ischemia/hypoxia,but it has a significant increase in group HE.Compared with the group C,the expression of BNP in myocardium was increased significantly in group HE,group EEP and group LEP,but the level of BNP in plasma significantly increase only in group HE and group EEP,group LEP has no significant difference.As compared with group HE,there was a significant decrease in the level of cTnI and the degree of myocardial ischemia/hypoxia in group EEP+HE and group LEP+HE.Compared with group HE,the expression of BNP in myocardium was increased significantly in group EEP+HE and group LEP+HE,but the level of BNP in plasma significantly increase only in group LEP+HE,group EEP+HE has no significant difference.Conclusion:exercise preconditioning can induce myocardium to produce BNP,and BNP participated in cardioprotective effect of exercise preconditioning.

B-typenatriureticpeptide;exercisepreconditioning;cardioprotection;myocardialinjury;rat

1000-677X(2014)09-0031-08

2013-12-19；

：2014-08-06

国家自然科学基金资助项目(31071031)。

刘泽广(1987-)，男，河南安阳人，在读硕士研究生，主要研究方向为运动与心血管形态和机能，E-mail：richard_liu2013@163.com；潘珊珊(1957-)，女，江苏常州人，教授，博士研究生导师，主要研究方向为运动与心血管形态和机能，Tel(021) 51253252,E-mail：panshanshan20-13@163.com。

上海体育学院 运动科学学院，上海 200438 School of Kinesiology,Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China.

G804.5

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