抗阻训练对心梗大鼠心肌Neuregulin-1的表征和心脏结构与功能的影响

蔡梦昕，王庆安，田振军

抗阻训练对心梗大鼠心肌Neuregulin-1的表征和心脏结构与功能的影响

蔡梦昕，王庆安，田振军

目的：探讨抗阻训练对心梗(Myocardial Infarction,MI)大鼠心肌组织中神经调节蛋白(Neuregulin-1,NRG1)及其信号通路表达的影响及其对心脏结构与功能的保护效应。方法：3月龄雄性SD大鼠，体重180～220 g，随机分为假手术组(Sham)、心梗组(MI)和心梗抗阻训练组(MR)，每组10只。MI和MR组结扎左冠脉前降支(LAD)，建立MI模型。其中MR组于术后1周进行为期4周的抗阻训练，结束后测定心功能；采用石蜡切片和HE、Masson染色技术观察并计算组织形态学变化和胶原容积分数(Collagen volume fraction,CVF)，采用免疫组化、Real Time-qPCR和Western Blotting技术检测心肌血管新生、细胞凋亡等相关蛋白α-SMA、CD105、BCL-2和Bax以及NRG1及其受体ErbB2/4和下游信号通路蛋白的表达变化。结果：抗阻训练有效提升了MI大鼠心功能，改善心肌细胞病理性肥大；促进非梗死区心肌α-SMA和CD105表达、显著升高BCL-2/Bax比值；显著增加MI大鼠心肌NRG1蛋白的表达和erbb2 mRNA表达，升高PI3K-Akt和ERK1/2的磷酸化水平。结论：本研究发现，抗阻训练可改善MI心脏的病理性重塑，促进非梗死区血管新生，抑制心肌细胞凋亡，安全有效的改善MI心脏的功能；抗阻训练可促进心肌NRG1及其ErbBs的表达，其心脏的保护效应与心肌NRG1/ErbBs及PI3K/Akt和ERK1/2信号通路激活有关。

抗阻训练;心肌梗死;心脏保护;神经调节蛋白1;心肌修复

心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)后心肌缺血引起梗死区心肌细胞坏死、凋亡，心脏发生替代性纤维化，严重损害心功能[32]。如何改善心脏的病理性重构，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌细胞和血管再生，降低心肌纤维化水平，促进其结构与功能有效恢复，一直是心血管基础和临床研究的热点问题。

近10年的动物和人体临床研究表明，耐力性锻炼作为重要的心血管疾病预防和康复手段，在预防MI发生和后期康复等方面均发挥积极作用，可降低细胞凋亡程度[9]、减轻心肌纤维化[38,39]和促进血管再生[25]，有效提升心功能和改善左室重塑现象[11,14,18]。根据临床转化医学和MI患者的临床特点，从改善MI(或心衰)患者生存质量与并发症分析，抗阻训练可能会更安全有效。针对MI疾病，如何选择科学、安全、有效的康复运动方式，一直备受学者和临床专家的高度关注，尤其是心脏负荷相对较小的抗阻训练对改善MI心脏结构与功能的影响及其机制研究，目前文献报道尚缺。

神经调节蛋白1(Neuregulin-1,NRG1)在心脏发育及成体心功能维持中发挥重要作用[31]。研究发现，内皮细胞释放NRG1与心肌细胞上其受体ErbB4结合后，可促进MI后心脏中单核心肌细胞增殖，修复损伤心脏[3]。注射 rhNRG-1可抑制大鼠心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡[26]。大量研究表明，NRG1与ErbBs结合后激活PI3K/Akt和ERK1/2等通路，在心肌细胞肥大和增殖、心肌血管再生和抑制心肌细胞凋亡等方面发挥作用，已成为近年来高度关注的心脏保护因子[3,13,17]。但运动与心脏NRG1表征的研究报道十分有限[35]，且尚缺乏针对MI心脏的研究报道。本研究拟探讨抗阻训练对MI大鼠NRG1及其信号通路和心脏结构与功能的影响，以期为MI等心脏疾病筛选科学、安全、有效的康复运动方式提供实验依据，并探讨抗阻训练对MI保护效应的生物学机制。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：ALC V8动物呼吸机、PowerLab/8ST生物信号采集处理系统、LEICA RM2126切片机、BMⅡ型病理组织包埋机、生物组织摊烤片机、尼康荧光显微镜、BX51奥林巴斯光学显微镜、Bio Tek epoch超微量微孔板分光光度计、Bio Rad CFX96荧光定量PCR仪、Bio Rad电泳仪和转移槽等。

主要试剂：兔多克隆抗体α-SMA和CD105(美国Abcam公司)，BCL-2、Bax、NRG1、ErbB2和ErbB4(bioworld公司)，PI3K、pPI3K、Akt、pAkt、ERK1/2和pERK1/2(美国CST公司)，nrg1、erbb2和erbb4引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，反转录试剂盒(美国Thermo Scientific公司)、SYBR Green I荧光染料(GenStar北京康润公司)。

1.2 动物实验分组、MI大鼠模型制备和抗阻训练方案制定

动物实验分组：3月龄雄性Sprague Dawley大鼠(购自西安交通大学医学院实验动物中心，合格号为SCXK2013-003)，适应性喂养1周后，随机选取10只为假手术对照组(Sham)，余下大鼠全部进行左冠脉前降支(LAD)结扎术，1周后随机分为心梗组(MI)和心梗抗阻训练组(MR)，每组10只。大鼠分笼饲养，每笼5只，自由进食、饮水。

MI大鼠模型制备：大鼠称重后，腹腔麻醉(5%戊巴比妥钠，30 mg/kg)，采用人工面罩正压通气呼吸，心电图监测手术过程。在大鼠左侧第4肋骨位置开胸剥离心包，暴露心脏，采用3/8U型圆缝合针和5-0丝线在左心耳和肺动脉圆锥交界处下缘2 mm处进针，深度为0.3～0.5 mm，结扎LAD，以左室心肌颜色变浅或变白，心电图ST段抬高，出现病理性Q波或T波倒置为结扎成功标志，之后逐层缝合肌肉和皮肤。Sham组只进针穿线，不结扎。

抗阻训练方案：根据文献资料及前期预实验确定抗阻训练方案[22]。训练组大鼠术后7 d进行爬梯抗阻训练。爬梯高1.1 m，间隔2 cm，倾斜角度为80°。第1周为适应性训练，以不负重起始，每天以10%体重的负荷递增，终负荷为体重的75%，5 d/周，共4周。

1.3 血流动力学指标测定和死亡率统计

大鼠训练结束后次日，腹腔麻醉，采用右颈总动脉逆行插管术将导管送至左心室，PowerLab/8ST信号采集系统记录左心室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左心室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)和左心室压力变化速度(±dp/dt max)。

1.4 取材、样品处理和组织学实验方法

血流动力学指标测试结束后，立刻开胸摘取心脏，组织学实验的标本于10%中性甲醛溶液固定48 h后制片。用于Western Blotting和Real Time-qPCR实验的标本入液氮24 h后，移至-80℃低温冰存备用。

甲醛固定样本进行石蜡包埋，连续切片(厚5 μm)。每张HE染色切片选取10个视野，每个视野选择10个胞核位于中央的心肌细胞，测量其横截面积。每张Masson染色切片测量心肌胶原容积分数(Collagen Volume Fraction,CVF)。CVF=胶原面积/心肌组织总面积×100%(不包括血管周围胶原面积)。

免疫组化实验严格按照SABC免疫组化染色试剂盒说明书操作步骤进行。切片脱蜡至水，PBS清洗，3%H2O2浸泡10 min以消除内源性过氧化物酶，微波抗原修复，山羊血清封闭液37℃孵育30 min，甩去血清，孵育兔抗大鼠多克隆α-SMA(1∶400)和CD105(1∶200)抗体，4℃过夜。次日室温复温30 min，滴加生物素标记的山羊抗兔抗体，37℃孵育30 min，滴加SABC复合物，37℃孵育30 min，DAB显色，蒸馏水洗涤终止反应，常规脱水、透明，中性树胶封片。设置空白对照(PBS取代一抗和二抗)及阴性对照(PBS取代一抗)。

1.5 Real Time-qPCR和Western Blotting实验方法

Real Time-qPCR实验方法：常规Trizol试剂盒提取心肌组织总mRNA。严格按照反转录试剂盒说明书操作步骤，获得cDNA产物，20 μl反应体系进行实时荧光定量PCR反应，内部参照为gapdh。引物序列为：nrg1:F 5’-GCTAAGTCCACAACATACCTCAGA-3’，R 5’-AAGGGAG- CCAGAGAAGAAACTC-3’，退火温度53℃；erbb2:F 5’-TACCGACTGTTGAGGCAGAAC-3’，R 5’-TGAAGGAGAGTTTGAGGAGAT-3’，退火温度55℃；erbb4:F 5’-CTTGCCATCTCTTCCCTGA A-3’，R 5’-AATCGCCTCTGTGTTCTTTCTC-3’，退火温度56℃；gapdh:F 5’-CAGTGCCAGCCTC GTCTCAT-3’，R 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3’，退火温度55℃。

Western Blotting实验方法：取心肌组织50 mg左右，加入预冷蛋白抽提试剂，电动匀浆器匀浆，4℃离心12 000 rpm×15 min，取上清。BCA试剂盒进行蛋白定量。10%～12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，300 mA恒流转膜，3% BSA室温封闭1 h。孵育一抗BCL-2(1∶500)、Bax(1∶500)、NRG1(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、pPI3K(1∶2 000)、Akt(1∶1 000)、pAkt(1∶1 000)、ERK1/2(1∶2 000)和pERK1/2(1∶2 000)，4℃过夜。次日复温30 min，洗一抗，孵育山羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温50 min，洗二抗，ECL发光，内部参照为GAPDH。

1.6 图像与数据处理

2 实验结果

2.1 大鼠心功能测试结果

MI手术后实验大鼠共30只，实验过程中无一例死亡。血流动力学检测结果表明，与Sham组比较，MI组LVEDP显著升高(P<0.01)，LVSP和±dp/dtmax显著降低(P<0.01)；与MI组比较，抗阻训练有效降低了LVEDP水平(P<0.05)，显著提高了LVSP和±dp/dtmax水平(P<0.05,P<0.01，图1)。提示，MI严重损害了心功能，抗阻训练可显著改善心功能。

图 1 本研究大鼠心功能变化柱状图

2.2 大鼠心肌的组织学观察与测试结果

HE染色结果显示，Sham组大鼠心肌细胞排列紧密，结构清楚，细胞核染色清晰，呈蓝色，胞浆呈红色，区分明显；MI组大鼠梗死区心肌细胞大量坏死，心肌纤维排列紊乱，出现断裂、溶解等现象，部分胞浆嗜伊红性增强，梗死区的存活细胞、边缘细胞及梗死远端细胞均出现肥大现象(P<0.01)；MR组大鼠梗死区心肌细胞仍存在肥大现象，梗死边缘区细胞代偿性肥大现象有所改善(P<0.01)，非梗死区心肌细胞有肥大趋势，但无显著性差异(图2)。

Masson染色结果显示，胶原纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色，细胞核呈蓝紫色。Sham组心肌组织胶原纤维染色清晰，区分明显，细胞排列整齐，胶原纤维分布正常；MI组可见典型的替代性纤维化，胶原纤维过度增生，并向梗死边缘区和非梗死区延伸；MR组仍存在胶原纤维过度增生情况，CVF值有所下降，但无显著性差异，梗死区出现程度不同的存活心肌细胞岛和幼稚的心肌细胞(图3)。

图 2 本研究大鼠心肌细胞横截面积比较切片图

图 3 本研究大鼠心脏Masson染色结果切片图

2.3 大鼠心肌α-SMA和CD105表达结果

平滑肌肌动蛋白α-SMA在血管平滑肌中表达。CD105作为内皮细胞增殖的标记物，可反映血管增生情况。免疫组化结果显示，MI后梗死区α-SMA和CD105表达显著增加(P<0.01)。与MI组比较，MR组大鼠梗死区α-SMA表达减少(P<0.01)，梗死边缘区α-SMA和CD105表达增加(P<0.05)，非梗死区α-SMA表达增加(P<0.05)。提示，MI后梗死区发生代偿性血管新生，抗阻训练可改善MI区代偿现象，并促进梗死边缘和非梗死区的血管新生(图4)。

图 4 本研究大鼠心脏梗死区和梗死远端α-SMA和CD105表达情况

2.4 大鼠心肌BCL-2/Bax蛋白表达结果

BCL-2可通过拮抗促凋亡基因Bax抑制细胞凋亡现象，Bcl-2/Bax的比值可反映细胞凋亡抑制作用的强弱。Western Blotting结果显示，Sham、MI和MR组大鼠心肌组织中BCL-2表达无显著性差异，而MI组心肌Bax蛋白表达显著升高，抗阻训练干预后其表达下降。BCL-2/Bax比值在MI后显著降低(P<0.01)，而抗阻训练后表达显著升高(P<0.05)。提示，MI后心肌细胞发生显著凋亡，抗阻训练可有效抑制其凋亡水平(图5)。

图 5 本研究大鼠心肌Bcl-2和Bax蛋白表达变化

2.5 抗阻训练对心肌NRG1及其受体和PI3K/Akt和ERK1/2信号通路的影响

RT-qPCR结果显示，MI后心肌中nrg1 mRNA表达升高(P<0.05)，erbb2和erbb4 mRNA表达有升高趋势，但无显著差异。与MI组比较，MR组心肌中erbb2 mRNA表达升高(P<0.05)，erbb4 mRNA表达有升高趋势。Western Blotting结果显示，与Sham组比较，MI组NRG1有所升高，但无显著差异，抗阻训练显著促进了心肌组织中NRG1的表达(P<0.01)。与MI组比较，MR组心肌中pPI3K/PI3K、pAkt/Akt和pERK/ERK比值升高(P<0.05，P<0.01)。提示，抗阻训练可激活PI3K/Akt和ERK1/2通路(图6、图7、图8)。

图 6 本研究大鼠心肌NRG1蛋白表达变化

图 7 本研究大鼠心肌中nrg1及其受体erbb2和erbb4 mRNA表达变化柱状图

图 8 本研究大鼠心肌组织PI3K/Akt和ERK1/2及其磷酸化蛋白表达结果

3 分析与讨论

3.1 抗阻训练可安全有效的改善MI大鼠心功能

运动康复可有效提升MI患者心功能已得到证实，但针对MI后运动形式、强度及开始时间的选择，仍缺乏足够系统的探讨。传统的心脏康复计划主要是在MI临床的后期以有氧训练为主，适宜的耐力运动可有效逆转MI后心脏的病理性重塑，提高心功能[8]。MI发病早期，合理的康复训练有利于缓解心功能的进行性衰退和纤维化程度。然而，根据临床转化医学和MI患者的临床特点与并发症，有氧运动对心脏负荷较大，绝大多数MI患者早期进行大强度有氧运动存在风险。研究发现，MI可致心功能降低的同时，伴随着其它远隔器官的结构与功能的降低[16,27,34]。MI后早期进行抗阻训练诱发的心脏并发症几率小于有氧运动，并适合老年人群[5,6,30]。美国心脏学会提出抗阻训练可作为心血管疾病患者进行有氧运动康复的补充[37]，对改善MI(或心衰)患者的生存质量可能会更安全有效，但缺乏有力的实验支持，且其机制研究十分有限。研究表明，短期和长期的力量练习均可增加心系数。3个月抗阻训练可降低基础心率，使LVDP和±dp/dtmax值显著增加[1]。本研究结果表明，抗阻训练可显著升高MI大鼠的LVSP和±dp/dtmax值，降低LVEDP值，未出现动物死亡现象，表明抗阻训练可安全有效的改善心功能，为MI后的康复训练方式筛选提供了实验证据。

3.2 抗阻训练对MI心脏可产生保护效应

MI后，心肌缺血诱导梗死区心肌细胞数目减少并发生存活细胞病理性肥大，血管代偿性再生，胶原纤维过度增生并导致心肌替代性纤维化，进而导致MI心脏组织重构和心功能障碍。降低心肌替代性纤维化和心肌细胞代偿性肥大，抑制心肌细胞凋亡，促进心肌血管再生等心脏保护效应，对于维持MI心脏实质与间质成分比例，建立侧支循环并减缓后期病理性重塑意义重大。运动训练可改变心肌组织结构和功能，且与运动方式和强度相关。目前，运动对MI心脏的保护效应主要集中在有氧耐力训练方式。研究发现，适宜的有氧训练可诱导非梗死区心肌血管生成，改善血流状态和内皮功能[4,7,25,36]，抑制心肌细胞凋亡[9,20]。抗阻训练可增加左室质量，诱导心脏向心性肥大[2]，但对MI心脏是否也产生同样的保护效应，尚无文献报道。本研究结果发现，MI大鼠术后1周进行抗阻训练干预，梗死边缘区心肌细胞肥大显著降低，非梗死区肥大程度有所增加，且非梗死区心肌组织中α-SMA和CD105表达增多，BCL-2/Bax比值升高，显著抑制心肌细胞凋亡。提示，抗阻训练可改善病理性心肌肥大现象，促进非梗死区心肌血管新生，降低细胞凋亡水平，产生心脏保护效应。

3.3 抗阻训练促进心肌NRG1的表达，并激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路

NRG1是心血管系统中重要的细胞保护因子，在心脏发育、成体心脏功能维持和病理性心脏保护等方面发挥重要作用[10,29,31]。成体心脏NRG1主要在内皮细胞中表达，心肌细胞膜上有其受体ErbBs的表达。内皮细胞合成并释放NRG1，作用于心肌细胞发挥旁分泌效应[15,24]。心脏NRG-1/ErbBs在心衰早期高表达，晚期则降低，推测为早期室壁机械张力刺激心肌微血管内皮细胞的结果[21]。目前认为，NRG1的心脏保护效应主要表现在抑制心肌细胞凋亡[19]、促进血管新生[23,33]、降低心肌纤维化[26]和促进心肌再生[3]等方面。NRG1与ErbB4结合后，与ErbB2形成受体复合物，主要通过激活PI3K/Akt和ERK1/2以及FAK等信号通路，发挥心脏保护效应[28]。目前，NRG1已经成为心血管疾病的临床治疗靶点之一。Waring等发现，有氧运动可促进正常心肌NRG1显著高表达[35]，但尚缺对MI心脏的检测。本实验发现，MI后心肌中nrg1 mRNA表达显著升高，但其蛋白表达变化无显著差异。分析认为，MI后梗死及其边缘部位缺血缺氧，低氧诱导因子等细胞因子水平升高，诱导内皮细胞增殖标记CD105表达升高，从而上调内皮细胞中nrg1 mRNA水平。但由于NRG1表达随MI后时间变化而不同，且同时具有自分泌和旁分泌作用，其蛋白和基因水平并未出现同步性；抗阻训练促进了MI心脏NRG1蛋白及其受体erbb2 mRNA高表达，升高PI3K、Akt和ERK1/2信号蛋白的磷酸化水平，但nrg1 mRNA表达没有显著提升。提示，抗阻训练可激活NRG1/ErbBs及其下游信号通路，NRG1蛋白来源可能包括心源性NRG1以及外周源性NRG1。表明，抗阻训练发挥心脏保护效应可能与NRG1/ErbBs信号通路激活有关。

根据本研究实验和文献结果推测，抗阻训练发挥心脏保护效应可包括：1)对心脏产生直接保护效应。MI后心功能的提升由多种因素决定，抗阻训练对心脏和血管产生间接应力刺激，直接引起心肌形态结构改变，促进包括NRG1在内的多种细胞因子的表达，发挥自分泌或旁分泌作用，保护存活心肌细胞，降低心肌纤维化程度和心肌细胞丢失率，促进血管再生，改善氧化应激和神经内分泌调控等；2)促进外周器官的内分泌功能，参与心肌保护；3)提高外周血管内皮功能，改善机体内环境和代谢水平。研究表明，长期抗阻训练可使左心室壁厚度增加，提高外周血管内皮功能[12]，减轻个体心血管压力负荷，减少氧自由基的产生，降低氧化应激损伤[1]。因此认为，抗阻训练可改善MI后机体代谢水平，是心脏康复运动方案中不可或缺的组成部分。抗阻训练可促进心源性NRG1以及外周源性NRG1的分泌，激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路，通过改善病理性心肌细胞肥大，抑制细胞凋亡和促进血管新生等方面发挥心脏保护效应。

4 结论

本研究发现，抗阻训练可改善MI心脏的病理性重塑，促进非梗死区血管新生，抑制心肌细胞凋亡，安全有效地改善MI心脏的功能；抗阻训练可促进心肌NRG1及ErbBs的表达，其心脏的保护效应与心肌NRG1/ErbBs信号及PI3K/Akt和ERK1/2信号通路激活有关。

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InfluenceofResistanceTrainingonMyocardialNeuregulin-1ExpressionandCardiacStructureandFunctioninRatswithMyocardialInfarction

CAI Meng-xin,WANG Qing-an,TIAN Zhen-jun

Objectives:To discuss the influence of resistance training on cardiac structure and function,expression of Neuregulin-1(NRG1) and its signaling pathway in rats with myocardial infarction (MI).Methods:Adult male sprague-dawley rats,3-mouth old,weight about 180-220g were randomly divided into three groups:Sham-operated group (Sham),sedentary MI group (MI) and MI with resistance training group (MR).The MI model in rat was established by ligation of the left anterior descending (LAD) coronary artery,and rats in MR were subjected to 4-week resistance training.At the end of the 4-week training,hemodynamic measurement was preformed to evaluate cardiac function;after that the heart was picked for histological section.The expression levels of α-SMA,CD105,BCL-2,Bax,NRG1,ErbB2,ErbB4,PI3K,Akt and ERK1/2 were detected by Immunohistochemical measurement,Western Blotting or RT-qPCR.Results:Compared with MI group,resistance training has effectively promoted cardiac function and the pathological myocardial hypertrophy,increased BCL-2/Bax ratio and the expression of α-SMA,CD105,NRG1 protein and erbb2,erbb4 mRNA in myocardial tissue,upregulated the phosphorylation levels of PI3K-Akt and ERK1/2 signal.Conclusion:Resistance training could improve the cardiac function by ameliorating cardiomyocyte pathologic hypertrophy,inhibiting apoptosis and promoting angiogenesis after MI,its mechanism may be associated with NRG1 and the activation of its downstream signaling pathways.

resistancetraining;myocardialinfarction;cardioprotection;Neuregulin-1;cardiacrepair

1000-677X(2014)09-0024-08

2014-03-21；

：2014-08-14

国家自然科学基金项目(31040045,31171141, 31371199)；陕西师范大学“211工程”—运动生物学重点建设学科项目(2014-02)。

蔡梦昕(1987-)，女，河南商丘人，在读博士研究生，主要研究方向为运动心脏生物学，E-mail：tianzj2011@126.com；王庆安(1990-)，男，山东泰安人，硕士研究生，主要研究方向为运动心脏生物学；田振军(1965-)，男，陕西绥德人，教授，博士研究生导师，主要研究方向为运动心血管生物学，Tel：(029)85308092，E-mail：tianzj611@hotmail.com。

陕西师范大学 体育学院暨运动生物学研究所，运动与心血管研究室，陕西 西安710062. Shaanxi Normal University,Xi’an 710062,China.

G804.5

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