废啤酒酵母中碱不溶性胞壁多糖提取工艺的优化

张勇　周丽明

摘要：以废啤酒酵母为原料，采用NaOH溶液提取碱不溶性酵母胞壁多糖，用正交试验优化提取工艺。结果表明：最佳提取工艺条件为：料液比为1 g ∶10 mL，处理时间1 h，处理温度100 ℃，碱液浓度1 mol/L，在此工艺条件下酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

关键词：碱不溶性；胞壁多糖；废啤酒酵母；提取工艺

中图分类号： TS261.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0230-02

收稿日期：2013-04-22

作者简介：张勇（1978—），男，湖北襄阳人，硕士，讲师，从事生物活性物质研究。E-mail：1328662368@qq.com。酵母细胞壁中存在碱不溶性葡聚糖、碱溶性葡聚糖、酸溶性葡聚糖等物质。其中不溶性葡聚糖具有黏性高、热稳定性好以及制备工艺简单等优点，被广泛应用于食品、医药、化妆品、造纸、建筑等行业[1]。我国酵母资源丰富，年产啤酒沉淀酵母泥3万～5万t（干基）[2]。啤酒酵母细胞壁含有大量多糖，约占酵母细胞干重的40%[3]。目前关于从啤酒废酵母中提取蛋白质、核酸、谷胱甘肽等研究很多[4]，对其胞壁多糖的研究尚不多见。笔者对从废啤酒酵母中提取碱不溶性酵母胞壁多糖的工艺条件进行了研究，旨在为废啤酒酵母的综合利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

废啤酒酵母（湖北金龙泉啤酒有限公司）、试剂均为国产分析纯，320-S型pH计[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）]，DZT-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），722S型可见光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），HN-12A型红外消化炉（上海勇规分析仪器有限公司）。

1.2溶液的配制

标准葡萄糖溶液制备：取105 ℃干燥至恒重的D-葡萄糖，精确称重，配成浓度为3.62 mg/mL的标准储备液，使用前用蒸馏水稀释成浓度为0.036 2 mg/mL的标准葡萄糖使用液。80%苯酚：80 g苯酚（分析纯重蒸馏试剂），加20 g水使之溶解，置冰箱中长期避光贮存。6%苯酚：临用前用80%苯酚配制。

1.3方法

1.3.1标准曲线的制作采用苯酚-硫酸法[5]。分别吸取标准葡萄糖液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL于试管中，各加水补至2.0 mL，另一试管加入2.0 mL蒸馏水作为空白对照。各试管分别加入6%苯酚1.0 mL，然后冷水浴中迅速加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，并于冷水浴中放置5 min，再置于沸水浴中加热15 min，取出冷却至室温后于490 nm处测其吸光度值，得标准曲线。

1.3.2酵母胞壁多糖提取与纯化方法碱不溶性葡聚糖提取与纯化工艺流程如下：废啤酒酵母→碱液处理→中和→溶剂洗涤→干燥→酵母胞壁多糖。用一定浓度一定体积的碱液（NaOH）对100 g废啤酒酵母在一定温度下搅拌一定时间，冷却后用HCl调节pH值为 4.5，3 000 r/min离心20 min后弃上清液，沉淀即为酵母胞壁多糖粗品。用200 mL蒸馏水洗出沉淀，100 ℃水浴20 min，3 000 r/min离心20 min；用100 mL 95%乙醇洗出沉淀，用电动搅拌器搅拌15 min后3 000 r/min离心20 min，重复1次；用100 mL丙酮洗出沉淀，搅拌15 min后3 000 r/min离心20 min，重复1次；用100 mL无水乙醚洗出沉淀，搅拌15 min，3 000 r/min离心20 min，沉淀置于沸水浴中挥发残余无水乙醚；最后置于37 ℃下真空烘干，即得酵母胞壁多糖成品。

1.3.3酵母胞壁多糖中多糖含量测定方法[6]称取约 10 mg 酵母胞壁多糖，用20 mL 3 mol/L H2SO4于100 ℃水浴 90 min，然后将水解液定容至250 mL。吸取水解液1.0 mL，按“1.3.1”节方法操作，测其吸光度值。根据回归方程计算水解液中多糖的浓度，按下式计算酵母胞壁多糖提取率。

多糖提取率=水解液中多糖浓度（mg/L）×250×胞壁多糖成品质量（g）1称取的胞壁多糖质量（mg）×废啤酒酵母质量（g）×100%

2结果与分析

2.1标准曲线

由图1可知，葡萄糖含量在0～0.065 16 mg范围内与其吸光度值线性关系良好，在此范围内的线性回归方程为：y=0.005 7x+0.000 8，r=0.999 8。

2.2单因素试验

2.2.1料液比对酵母胞壁多糖提取率的影响在处理温度为100 ℃、处理时间为1 h条件下，选择料液比（g ∶mL）分别为1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25，将废啤酒酵母悬浮于 1 mol/L NaOH溶液中，考察料液比对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图2可知，当料液比达到1 g ∶10 mL时酵母胞壁多糖提取率达到最大，继续减小料液比，多糖提取率下降，这可能是由于NaOH用量增大后，在溶出杂质的同时对多糖也有一定的破坏性，所以确定料液比为1 g ∶10 mL。

2.2.2处理时间对酵母胞壁多糖提取率的影响在处理温度为100 ℃、料液比为1 g ∶10 mL条件下，将废啤酒酵母悬浮于 1 mol/L NaOH溶液中分别处理0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察处理时间对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图3可知，当处理时间为1 h时，提取率达到最大，之后再延长处理时间，提取率反而下降。可见，若处理时间过长，在除去杂质的同时也会破坏多糖，致使提取率下降，所以1 h为最佳处理时间。

2.2.3处理温度对酵母胞壁多糖提取率的影响在料液比为1 g ∶10 mL的条件下，选择处理温度分别为60、70、80、90、100 ℃，将废啤酒酵母悬浮于1 mol/L的NaOH溶液中处理 1 h，考察处理温度对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图4可知，当处理温度为100 ℃时，提取率最高。这可能是由于温度比较低时，碱溶不彻底，杂质较多，故选择处理温度为100 ℃。endprint

2.2.4碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响在处理温度为100 ℃、料液比为1 g ∶10 mL的条件下，将废啤酒酵母分别悬浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中处理1 h，考察碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图5可知，当碱液浓度为1 mol/L时提取率最高。随着碱液浓度的提高，杂质不断被溶解的同时多糖也在一定程度上被降解，碱液浓度越大，对多糖的破坏越严重，故选择碱液浓度为1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工艺的确定

为了确定酵母胞壁多糖提取最佳工艺，在单因素试验的基础上设计了4因素3水平正交试验L9（34）（表1）。由表2可知，4种因素对酵母胞壁多糖提取率影响的主次顺序依次为：料液比>碱液浓度>处理时间>处理温度。酵母胞壁多糖的最佳提取条件是A1B1C3D2，即料液比为1 g ∶10 mL，处理时间1 h，处理温度100 ℃，碱液浓度1 mol/L。按此条件进行试验，酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

3结论

本研究表明，NaOH溶液提取碱不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工艺条件为料液比1 ∶10，处理时间1 h，处理温度 100 ℃，碱液浓度1 mol/L，在此工艺条件下酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

参考文献：

[1]胡晓忠，冯万祥. 酵母葡聚糖的制备及理化性质[J]. 华东理工大学学报，1999，25（5）：477-479.

[2]黄国宏，李科德，曾庆孝. 酵母β-1，3-葡聚糖研究进展[J]. 酿酒科技，2006（12）：100-103.

[3]段胜林，王雪，苑鹏，等. 采用催化自溶和生物破壁技术提取啤酒酵母细胞壁多糖[J]. 食品与发酵工业，2012，38（5）：138-143.

[4]杨建梅. 啤酒废酵母中β-1，3-D-葡聚糖的制备及性质研究[D]. 泰安：山东农业大学，2012.

[5]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：132-136.

[6]张勇. 酵母多糖的研究——产多糖酵母菌株筛选、发酵工艺及酵母多糖提取、分离纯化和免疫活性的研究[D]. 武汉：湖北工业大学，2005.吴真，林鹿. 麦草水解残渣制备活性炭[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：232-233.endprint

2.2.4碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响在处理温度为100 ℃、料液比为1 g ∶10 mL的条件下，将废啤酒酵母分别悬浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中处理1 h，考察碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图5可知，当碱液浓度为1 mol/L时提取率最高。随着碱液浓度的提高，杂质不断被溶解的同时多糖也在一定程度上被降解，碱液浓度越大，对多糖的破坏越严重，故选择碱液浓度为1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工艺的确定

为了确定酵母胞壁多糖提取最佳工艺，在单因素试验的基础上设计了4因素3水平正交试验L9（34）（表1）。由表2可知，4种因素对酵母胞壁多糖提取率影响的主次顺序依次为：料液比>碱液浓度>处理时间>处理温度。酵母胞壁多糖的最佳提取条件是A1B1C3D2，即料液比为1 g ∶10 mL，处理时间1 h，处理温度100 ℃，碱液浓度1 mol/L。按此条件进行试验，酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

3结论

本研究表明，NaOH溶液提取碱不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工艺条件为料液比1 ∶10，处理时间1 h，处理温度 100 ℃，碱液浓度1 mol/L，在此工艺条件下酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

参考文献：

[1]胡晓忠，冯万祥. 酵母葡聚糖的制备及理化性质[J]. 华东理工大学学报，1999，25（5）：477-479.

[2]黄国宏，李科德，曾庆孝. 酵母β-1，3-葡聚糖研究进展[J]. 酿酒科技，2006（12）：100-103.

[3]段胜林，王雪，苑鹏，等. 采用催化自溶和生物破壁技术提取啤酒酵母细胞壁多糖[J]. 食品与发酵工业，2012，38（5）：138-143.

[4]杨建梅. 啤酒废酵母中β-1，3-D-葡聚糖的制备及性质研究[D]. 泰安：山东农业大学，2012.

[5]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：132-136.

[6]张勇. 酵母多糖的研究——产多糖酵母菌株筛选、发酵工艺及酵母多糖提取、分离纯化和免疫活性的研究[D]. 武汉：湖北工业大学，2005.吴真，林鹿. 麦草水解残渣制备活性炭[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：232-233.endprint

2.2.4碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响在处理温度为100 ℃、料液比为1 g ∶10 mL的条件下，将废啤酒酵母分别悬浮于0.5、0.75、1、1.25、1.5 mol/L NaOH溶液中处理1 h，考察碱液浓度对酵母胞壁多糖提取率的影响。由图5可知，当碱液浓度为1 mol/L时提取率最高。随着碱液浓度的提高，杂质不断被溶解的同时多糖也在一定程度上被降解，碱液浓度越大，对多糖的破坏越严重，故选择碱液浓度为1 mol/L。

2.3酵母胞壁多糖提取最佳工艺的确定

为了确定酵母胞壁多糖提取最佳工艺，在单因素试验的基础上设计了4因素3水平正交试验L9（34）（表1）。由表2可知，4种因素对酵母胞壁多糖提取率影响的主次顺序依次为：料液比>碱液浓度>处理时间>处理温度。酵母胞壁多糖的最佳提取条件是A1B1C3D2，即料液比为1 g ∶10 mL，处理时间1 h，处理温度100 ℃，碱液浓度1 mol/L。按此条件进行试验，酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

3结论

本研究表明，NaOH溶液提取碱不溶性酵母胞壁多糖的

最佳工艺条件为料液比1 ∶10，处理时间1 h，处理温度 100 ℃，碱液浓度1 mol/L，在此工艺条件下酵母胞壁多糖提取率为2.88%。

参考文献：

[1]胡晓忠，冯万祥. 酵母葡聚糖的制备及理化性质[J]. 华东理工大学学报，1999，25（5）：477-479.

[2]黄国宏，李科德，曾庆孝. 酵母β-1，3-葡聚糖研究进展[J]. 酿酒科技，2006（12）：100-103.

[3]段胜林，王雪，苑鹏，等. 采用催化自溶和生物破壁技术提取啤酒酵母细胞壁多糖[J]. 食品与发酵工业，2012，38（5）：138-143.

[4]杨建梅. 啤酒废酵母中β-1，3-D-葡聚糖的制备及性质研究[D]. 泰安：山东农业大学，2012.

[5]张惟杰. 糖复合物生化研究技术[M]. 杭州：浙江大学出版社，1999：132-136.

[6]张勇. 酵母多糖的研究——产多糖酵母菌株筛选、发酵工艺及酵母多糖提取、分离纯化和免疫活性的研究[D]. 武汉：湖北工业大学，2005.吴真，林鹿. 麦草水解残渣制备活性炭[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：232-233.endprint