甘草皂苷对卡拉库尔羊血液中免疫球蛋白IgA和IgG的影响

刘俊峰　郭雪峰

摘要：为了研究甘草皂苷对卡拉库尔羊血液中免疫球蛋白IgA和IgG的影响，探讨甘草皂苷的免疫学效应。选取健康的卡拉库尔羊6只，随机分为2组，每组3只，平均体重为18.65 kg/只。饲养的第15、第30、第45天采集血液并分离血清，采用酶联免疫吸附法检测卡拉库尔羊血清中免疫球蛋白IgA、IgG的水平。结果显示：第15、第30、第45天的IgA试验组含量分别为84.75、93.16、86.31 μg/mL，对照组含量分别为43.13、42.57、32.63 μg/mL，且试验组显著高于对照组（P<0.05）；IgG试验组的含量分别为87.99、83.00、76.29 μg/mL，对照组的含量分别为46.05、43.57、41.55 μg/mL，且试验组显著高于对照组（P<0.05）。说明甘草皂苷可显著提高卡拉库尔羊血液中免疫球蛋白IgA、IgG的含量。

关键词：甘草皂苷；卡拉库尔羊；血液；IgA；IgG

中图分类号： S858.262.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0172-02

收稿日期：2013-05-31

基金项目：新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室课题（编号：HS201106）；新疆生产建设兵团博士基金（编号：2009JC08）。

作者简介：刘俊峰（1980—），男，内蒙古乌兰察布人，硕士，讲师，从事兽医药理与免疫药理学研究。E-mail：liujunfeng423@163.com。

通信作者：郭雪峰，博士，副教授，从事反刍动物营养与饲料添加剂研究。E-mail：guoxuefeng807@163.com。甘草皂苷别称甘草酸，是甘草的主要成分之一[1]，具有甜味（即甘草甜素），它属于三萜类皂苷，为次生代谢产物。由于它的水溶液容易引起肥皂样持久性泡沫，因此称之为皂苷。随着免疫学的迅速发展，对中草药添加剂的免疫药理研究也取得了较快的发展。国内外许多科学家对中草药添加剂在人、畜疾病上的免疫，尤其是与免疫有关的疾病防治进行了大量的科学研究。例如，苜草素是一种苜蓿提取物，能增强免疫系统功能，相对减少了营养的沉积量[2]；黄芪皂苷能提高和促进调节机体免疫功能。另外，还有一些关于皂苷对人的免疫及其他应用的研究，如高血脂病人应用甘草甜素后，血浆免疫球蛋白IgG、IgA及补体C3含量均显著降低，其作用主要为免疫增强、免疫调节和免疫抑制3种。皂苷成分类型多样，结构复杂，性质不稳。

20世纪80年代，日本学者首次用试验证明，甘草甜素可抑制HIV增殖，并具有免疫激活作用[3]。张娴文等发现三七皂苷具有抗肝纤维化作用[4]。甘草皂苷主要具有增强巨噬细胞和细胞免疫的功能，但对体液免疫功能有抑制作用。甘草提取物抑制抗体的作用已经有不少报道，以羊的红细胞作为抗原免疫动物，其注射后不久，受抑制反应就会明显，而抑制程度与甘草提取物的剂量有关；甘草皂苷也可以促进羔羊生长，提高绵羊产毛量和产奶量；对绵羊疾病防治都有过研究，其效果也相对突出。本研究对卡拉库尔羊饲喂添加甘草皂苷的日粮，采集卡拉库尔羊血液并分离血清，测定免疫指标，旨在确定甘草皂苷对卡拉库尔羊血液IgA和IgG的影响，为开发以甘草皂苷为主要成分的饲料添加剂提供基础数据。

1材料与方法

1.1甘草皂苷的检验

1.1.1甘草的采集与前处理甘草于2012年3月在新疆阿克苏阿拉尔市十二团随机采集，将采集回来的甘草切成1～2 cm 的小段，晒至半干，再放于50 ℃恒温箱中烘干，再将样品放入精密粉碎机（xf-96b）中进行粉碎，重复2次，得到样本，采用新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室已经建立的提取方法提取甘草皂苷。

1.1.2皂苷的检测

1.1.2.1泡沫试验取检品的热水溶液2 mL于带塞试管中，用力振摇3 min，即产生持久性蜂窝状泡沫（维持10 min以上），且泡沫量不少于液体体积的1/3。

1.1.2.2醋酐浓硫酸试验取样品水溶液并置于平皿中，于水浴上蒸干，残渣加入少量冰醋酸使其溶解，再加入醋酐浓硫酸（19 ∶1）试液，呈现红紫色并变成绿色。

1.1.2.3比色法[5]准确吸取标准品溶液，置于具塞试管中，水浴挥干溶剂，加入一定量的5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入定量的高氯酸，摇匀，于水浴中加热，立即取出用流水冷却至室温，加入冰醋酸稀释，摇匀，以不加标准品的样品管为空白，于400～700 nm波长处进行扫描，香草醛高氯酸试剂在589 nm处有最大吸收峰，精密度高，加样回收率99.23%。

1.2卡拉库尔羊免疫球蛋白IgA、IgG的检测

1.2.1试验动物的饲养管理选取健康的卡拉库尔羊6只，随机分为2组，每组3只，平均体重为18.65 kg/只。试验所用基础日粮参照我国苏尼特羊营养标准[6-7]配制，精粮组成为：玉米68.53%，麸皮3.08%，胡麻饼20.09%，预混料804%，食盐0.27%；营养水平为：消化能8.41 MJ/kg，粗蛋白11%，钙4.96%，磷2.93%。精粗比为30 ∶70，精料 0.30 kg/（只·d），粗料为棉籽壳0.26 kg/（只·d）及青贮 0.44 kg/（只·d）。甘草皂苷在日粮中的添加量为 150 mg/kg，甘草皂苷由新疆阿拉尔新农甘草产业有限责任公司按照试验要求提供，经检验符合试验标准。

1.2.2采血及血液处理静脉采血5 mL，注入真空采血管，3 000 r/min离心10 min，取上清4 ℃冷藏待测。

1.2.3IgA、IgG检测确定标准品中IgA的浓度梯度为160、80、40、20、10、5 μg/mL，IgG的浓度梯度则为64、32、16、8、4、2 μg/mL。由标准品稀释5倍得到样品稀释液，用稀释液浓度和D值共同绘制标准曲线。根据ELISA检测试剂盒说明书，检测卡拉库尔羊血清样品中IgA、IgG的含量。

1.3数据处理

试验结果用“平均值±标准差”表示，数据统计分析采用SPSS 17.0软件中的平衡试验设计方差分析过程（ANOVA），均值的多重比较采用Duncans法进行，同时绘制标准曲线。

2结果与分析

2.1甘草皂苷提取结果检测

由泡沫试验、醋酐浓硫酸试验、比色法证明试验所的甘草提取物为甘草皂苷。

2.2甘草皂苷对卡拉库尔羊IgA含量的影响

2.2.1IgA含量的拟合方程根据试剂盒说明书，利用紫外分光光度计，在波长450 nm、光径1 cm下，蒸馏水调零，测定标品吸光度（x），拟合方程为y=0.051 1x+0.195 2（r2= 0.994 7），其中y为样品IgA的含量，在0.05水平显著，该方程符合试剂盒要求，可以以此为标准计算样品中IgA含量。

2.2.2皂苷对IgA含量影响IgA为血清中的免疫球蛋白[7]，约占20%，结构有多体形态，免疫功能分为血清型和分泌型，缺乏会导致体液免疫降低。有研究表明，马的血液中IgA含量为27.5～120 μg/mL，绵羊的正常IgA含量范围为 10～150 μg/mL，而人的正常范围在0～3 900 μg/mL。本试验测得卡拉库尔羊血液中IgA的含量在32～94 μg/mL范围内，与其他动物结果一致，说明本试验结果属于正常范围。由表1看出，在第15、第30、第45天测得试验组卡拉库尔羊血液中IgA含量均显著大于对照组（P<0.05）。说明甘草皂苷能显著提高卡拉库尔羊血液中免疫球蛋白IgA含量。 表1添加甘草皂苷对卡拉库尔羊血清中IgA的影响

组别1各试验期血清中IgA含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值对照组143.23±28.92a142.57±32.93a132.63±32.04a139.47±31.29a试验组184.75±21.10b193.16±22.47b186.31±9.31b188.07±17.63b注：同列数据后标有不同小写字母者表示差异显著（P<0.05）。下表同。

2.3甘草皂苷对卡拉库尔羊IgG含量的影响

2.3.1IgG含量的拟合方程根据试剂盒说明书拟合本试验IgG回归方程，放入紫外分光光度计，在波长450 nm、光径1 cm下，蒸馏水调零，测定标品吸光度（x），拟合方程为y=0019 9x+0.232 7（r2=0.992 8），其中y为样品IgG的含量，在0.05水平显著，该方程符合试剂盒要求，可以此为标准计算样品中IgG含量。

2.3.2甘草皂苷对卡拉库尔羊血清中IgG含量的影响IgG是血清中的免疫球蛋白，是血清的主要抗体成分，约占血清的50%，其半寿命期为10.6～14.5 d，在机体免疫中起保护作用，大多具有抗菌、抗病毒等感染性疾病的作用。有研究表明，兔子的血液中IgG含量为17.5～800.0 μg/mL；小鼠血液中的IgG含量为12.5～40.0 μg/mL。本试验测得卡拉库尔羊血液中IgG含量在41～87 μg/mL之间，在报道的绵羊正常范围（17～120 μg/mL）之内。由表2可知，第15、第30、第45天所测得的试验组卡拉库尔羊血清中IgG含量均大于对照组，且差异显著（P<0.05）。说明本试验在饲料中添加甘草皂苷能使卡拉库尔羊的血液中IgG含量明显升高。表2添加甘草皂苷对卡拉库尔羊血清中IgG含量的影响

组别1血清中IgG含量（μg/mL）第15天1第30天1第45天1平均值对照组146.05±13.18a143.57±6.68a141.55±9.28a143.72±9.71a试验组187.99±21.75b183.00±19.80b176.29±15.60b182.43±19.05b

3结论

甘草皂苷具有非特异性免疫调节作用，经研究发现，甘草皂苷能显著提高小鼠对静脉碳粒的廓清指数，说明其不仅具有增强网状内皮系统的活性，同时具有非特异性免疫加强的作用，主要增强了细胞的免疫作用[8]，可选择性地增强辅助性T细胞的增殖能力和活性，使CD4细胞增加、CD8细胞减少及胸腺外T淋巴细胞分化，对γ-干扰素产生诱发作用和NK细胞活化作用。但由于甘草皂苷同时具有类固醇作用，因而不能简单地把它归为免疫抑制剂，实际上它可能是具有双向作用的免疫调节剂。本试验在饲料中添加甘草皂苷 150 mg/kg 饲喂卡拉库尔羊，能提高血液中的IgA、IgG含量，说明甘草皂苷能提高卡拉库尔羊的免疫水平。因此，可进一步开展关于饲料添加剂应用的研究，以提供更多的基础试验数据。

参考文献：

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