青花菜早中熟种质资源遗传多样性SRAP标记分析

荆赞革　裴徐梨　唐征　张小玲　罗天宽　刘庆　朱世杨

摘要：采用SRAP分子标记技术对12份青花菜早中熟种质资源进行遗传多样性分析。从48个引物组合中筛选得到28对多态性较好的引物组合，共检测到312条扩增条带，每个引物组合产生2至22个不等的条带，其中多态性片段为227条，多态性比例为75.76%，揭示所选青花菜种质资源间具有较为丰富的遗传多样性。相似系数分析表明种质间遗传相似系数为0.650 6～0.878 2，平均为0.786 2。聚类分析结果显示熟性和来源可作为青花菜早中熟种质聚类的重要农艺性状之一。

关键词：青花菜；遗传多样性；SRAP；早中熟种质

中图分类号：S635.303文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0041-03

收稿日期：2013-06-04

基金项目：浙江省重大科技专项（编号：2010C12004）；浙江省农业新品种选育重大科技专项（编号：2012C12903-3-3）；浙江省自然科学基金（编号：LY12C15009）；浙江省温州市科技项目（编号：N20090016）。

作者简介：荆赞革（1983—），男，河南三门峡人，博士研究生，助理研究员，研究方向为蔬菜遗传育种与生物技术。E-mail：jingzange@aliyun.com。

通信作者：唐征，硕士，副教授，主要从事蔬菜遗传育种与生物技术研究。Tel：（0577）88431228；E-mail：tzeng05@163.com。青花菜（Brassica oleracea var. italica）属十字花科芸苔属甘蓝种变种，别称西兰花、绿花菜、绿菜花等，是我国重要的蔬菜作物之一。它营养全面，含有丰富的维生素C和抗癌物质芥子油苷，深受消费者喜爱。种质资源是作物遗传改良的基础，种质资源占有量和研究利用的深度对育种工作的成效起着至关重要的作用。因此，深入研究青花菜种质资源遗传多样性可以较好地帮助育种者了解青花菜的遗传信息、遗传结构及种质间亲缘关系，有助于对现有种质资源进行有效利用与选择，从而加速青花菜新品种选育进程。SRAP即相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism），针对基因外显子、内含子来设计特异引物，因启动子、内含子及其间隔区长度不同而产生多态性[1]。该标记自2001年提出后，因其成本低、引物通用性强、多态性高、重复性好等诸多优点，在植物分子育种研究中应用广泛[2]。青花菜在我国的栽培时间较短，国内可供利用的育种材料有限，对青花菜种质资源鉴定评价等方面研究较少，因此笔者对搜集到的部分青花菜早中熟种质资源进行SRAP遗传多样性分析，从DNA水平上揭示其部分遗传信息和亲缘关系，以期为青花菜早中熟种质资源的搜集、鉴定与利用研究提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

以本研究所保存的12份青花菜早中熟种质资源为试验材料，进行常规田间管理。材料编号及相关信息见表1。

1.2基因组DNA提取

采用改良CTAB法[3]提取幼嫩叶片基因组DNA，经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测后，稀释成浓度为15 ng/μL的工作液，超低温冰箱保存备用。

1.3SRAP扩增和电泳检测

试验选用了4个正向引物和12个反向引物（表2）。以基因组DNA为模板进行PCR扩增， 反应体系（16 μL）：15 ng

扩增产物加入溴酚蓝后，吸取2 μL进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。60 V预电泳0.5 h，120 V稳压电泳1.5～2.0 h。电泳结束后用AgNO3进行染色：0.5%冰乙酸与10%乙醇混合水溶液固定15 min；2 g/L AgNO3水溶液银染 10 min；去离子水冲洗3次后，用含12 g/L NaOH、0.6%甲醛、0.02 g/L Na2S2O3的显色液显色至条带清晰后拍照[4]。

1.4数据处理

统计电泳检测结果并进行赋值，样品同一位置有电泳条带则赋值为1，无则赋值为0；强带和弱带均赋值为1。根据F值大小按不加权成对群算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic means cluster analysis，UPGMA）进行遗传聚类分析，并绘制亲缘关系树状图。

2结果与分析

2.1青花菜SRAP扩增结果

本试验从48个SRAP引物组合中，筛选出28个可稳定扩增、多态性较好的扩增引物组合。对12份早中熟青花菜种质进行扩增，28对引物组合共检测到312条清晰扩增条带，其中多态性条带为227条，多态性为75.76%。每对引物组合扩增的等位基因数差异较大，从2至22个不等，平均每对引物组合扩增数为11.14个，表明所选青花菜种质间具有较为丰富的遗传多样性。

2.2青花菜种质间的相似系数和聚类分析

根据SRAP分析结果，计算出12个青花菜种质间的遗传相似系数（表3）。从表3可以看出，绿玉（4）与绿地（5）、竞秀（7）与优秀（8）之间的遗传相似系数最大（0.878 2），绿玉（4）与美秀（11）的遗传相似系数最小（0.650 6），12个种质间平均相似系数为0.786 2。

3讨论

种质资源主要是通过遗传标记多态性来反映其遗传多样性。目前应用较为广泛的遗传标记主要有形态学标记、细胞学标记、同工酶标记和DNA分子标记等。其中形态学标记最简便易行，标记数量有限，受环境影响大，很大程度上限制了其应用。细胞学标记虽不受环境影响，但仍然存在着标记数量少的缺陷。同工酶标记具有共显性、分析快速、所需材料少等优点，但检测不到点突变和对酶蛋白电荷性质无影响的变异，会低估遗传变异[5]。用DNA分子标记法比较核苷酸序列的不同，是品种鉴定、遗传多样性分析的强有力工具。同其他遗传标记相比，DAN分子标记具有巨大的优越性[6]。

作为新一代的SRAP分子标记技术，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、马铃薯[13]、萝卜[14]、大葱[15]、黄瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多种作物的种质资源鉴定评价、遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建[1]、重要性状标记[20]和作物起源、进化及亲缘关系分析等方面都得到了较好的应用。

Hale等在2006年已经将SRAP标记用于青花菜的遗传多样性分析[21]，24个引物组合可检测到312条扩增条带，平均每个引物检测到13条，其中255条为多态性条带，多态率82%；比本试验平均每个引物检测到的条带数和多态性比例略高一些，可能是由选用试验材料和引物组合的不同所引起。

在聚类分析过程中，试验所用的28个SRAP引物可将12份青花菜早中熟种质资源分为2大类群。本研究结果显示，青花菜的聚类结果与其熟性密切相关，且同一来源的种质间具有相对相近的遗传基础，与前人研究结果[22-23]相符，即熟性和来源可作为青花菜聚类的重要分类农艺性状之一。

青花菜种质资源遗传多样性SRAP分析可为种质资源的研究提供更加准确和深入的理论依据。本研究利用SRAP标记技术，对12份来自不同国家和地区的的青花菜早中熟种质资源在分子水平上进行遗传多样性和亲缘关系分析，聚类分析结果可为保存这些种质制定正确策略，同时为青花菜早中熟种质资源的遗传改良和种质利用提供一定的理论基础。

参考文献：

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[20]雷剑，柳俊. 一个与马铃薯青枯病抗性连锁的SRAP标记筛选[J]. 中国马铃薯，2006，20（3）：150-153.

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[23]孙德岭，赵前程，宋文芹，等. 花椰菜类蔬菜自交系基因组间亲缘关系的AFLP分析[J]. 园艺学报，2002，29（1）：72-74.李树丽. 培养基中不同因素对中华红叶杨外植体褐变的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：44-46.

作为新一代的SRAP分子标记技术，自2001年提出后，目前已在水稻[7]、玉米[8]、油菜[9]、甜菜[10]、不接球白菜[11]、西瓜[12]、马铃薯[13]、萝卜[14]、大葱[15]、黄瓜[16-17]、甜椒[18]、大豆[19]等多种作物的种质资源鉴定评价、遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱构建[1]、重要性状标记[20]和作物起源、进化及亲缘关系分析等方面都得到了较好的应用。

Hale等在2006年已经将SRAP标记用于青花菜的遗传多样性分析[21]，24个引物组合可检测到312条扩增条带，平均每个引物检测到13条，其中255条为多态性条带，多态率82%；比本试验平均每个引物检测到的条带数和多态性比例略高一些，可能是由选用试验材料和引物组合的不同所引起。

在聚类分析过程中，试验所用的28个SRAP引物可将12份青花菜早中熟种质资源分为2大类群。本研究结果显示，青花菜的聚类结果与其熟性密切相关，且同一来源的种质间具有相对相近的遗传基础，与前人研究结果[22-23]相符，即熟性和来源可作为青花菜聚类的重要分类农艺性状之一。

青花菜种质资源遗传多样性SRAP分析可为种质资源的研究提供更加准确和深入的理论依据。本研究利用SRAP标记技术，对12份来自不同国家和地区的的青花菜早中熟种质资源在分子水平上进行遗传多样性和亲缘关系分析，聚类分析结果可为保存这些种质制定正确策略，同时为青花菜早中熟种质资源的遗传改良和种质利用提供一定的理论基础。

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Hale等在2006年已经将SRAP标记用于青花菜的遗传多样性分析[21]，24个引物组合可检测到312条扩增条带，平均每个引物检测到13条，其中255条为多态性条带，多态率82%；比本试验平均每个引物检测到的条带数和多态性比例略高一些，可能是由选用试验材料和引物组合的不同所引起。

在聚类分析过程中，试验所用的28个SRAP引物可将12份青花菜早中熟种质资源分为2大类群。本研究结果显示，青花菜的聚类结果与其熟性密切相关，且同一来源的种质间具有相对相近的遗传基础，与前人研究结果[22-23]相符，即熟性和来源可作为青花菜聚类的重要分类农艺性状之一。

青花菜种质资源遗传多样性SRAP分析可为种质资源的研究提供更加准确和深入的理论依据。本研究利用SRAP标记技术，对12份来自不同国家和地区的的青花菜早中熟种质资源在分子水平上进行遗传多样性和亲缘关系分析，聚类分析结果可为保存这些种质制定正确策略，同时为青花菜早中熟种质资源的遗传改良和种质利用提供一定的理论基础。

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