羟基红花黄色素A对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

潘 剑，李绍平，李建雄，连佛彦，黄 燕，秦 龙

(兰州大学第二医院：1.急救中心，2.神经内科，3.内科ICU，4.药学部，甘肃兰州 730030)

◇中医药研究◇

羟基红花黄色素A对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用

潘 剑1，李绍平1，李建雄2，连佛彦3，黄 燕4，秦 龙4

(兰州大学第二医院：1.急救中心，2.神经内科，3.内科ICU，4.药学部，甘肃兰州 730030)

目的观察羟基红花黄色素A(HSYA)对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用，并探讨其作用机制。方法采用MTT法检测细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡率；二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)法检测细胞内活性氧(ROS)含量；罗丹明123(Rhodamine123)染色法检测细胞线粒体膜电位；Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达。结果1 mmol/L MPP+处理SH-SY5Y细胞48 h后，细胞存活率显著降低，并诱导细胞产生凋亡，凋亡率达(38.6±1.8)%。而HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1 h，可明显增加SH-SY5Y细胞存活率(P＜0.001)，并能有效抑制MPP+诱导的细胞调亡(P＜0.01)；可明显抑制MPP+诱导的细胞内ROS的增加(P＜0.001)；也能有效抑制MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的降低(P＜0.01)。120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值(P＜0.01)；能够明显抑制MPP+诱导的胞质Cyt-C的释放(P＜0.05)和Caspase-3、Caspase-9的高表达(P＜0.05，P＜0.05)。结论HSYA预处理能明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率，可有效抑制细胞调亡的发生，其机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。

羟基红花黄色素A；SH-SY5Y细胞；细胞凋亡；线粒体

神经元的凋亡广泛参与脑血管病及一些神经退行性疾病的发病，如脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病和帕金森病等。研究发现，活性氧的释放及由此导致的线粒体损伤在神经元的凋亡过程中发挥非常关键的作用［1-2］，因而常把减轻氧化应激和抑制线粒体凋亡作为神经保护药物筛选的重点。

红花黄色素(carthamin yellow)是菊科植物红花花瓣中的最主要的色素成分，而羟基红花黄色素A (hydroxysafflor yellow A，HSYA)是红花黄色素中主要的水溶性单体成分，也被认为是红花药理功效的最有效成分［3-4］。近年来研究显示，红花黄色素以及HSYA具有明显的抗氧化作用，可清除羟自由基和脂质过氧化物等［5-6］，同时能改善脑微小循环障碍，对脑缺血再灌注损伤也具有明显的保护作用［7-8］，这提示红花黄色素在拮抗神经细胞损伤性疾病方面可能很有潜力。本研究以MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡为模型，研究HSYA对SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用及其可能机制，为红花的神经保护作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 药物及试剂羟基红花黄色素A(BRS011748，纯度＞98%，成都贝斯特试剂有限公司)；DMEM/ F12(1∶1)高糖培养基，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)，1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)(美国Sigma公司)；二乙酸二氯荧光素盐(DCFH-DA)活性氧检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；细胞凋亡罗丹明123(Rhodamine123)染色试剂盒和Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒均(南京凯基生物科技发展有限公司)。Cyt-C、Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3、β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3 仪器二氧化碳培养箱(美国SIM公司)，Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)，全自动酶标仪(德国BIO-RAD，Model 1550)，高速冷冻离心机(德国HERMLE公司)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养 用含有100 U/m L青霉素和100 μg/m L链霉素和100 m L/L胎牛血清的DMEM/ F12(1∶1)高糖培养基于37℃、50 m L/L CO2条件下培养SH-SY5Y细胞。2～3 d用1 g/L胰蛋白酶消化传代1次，待细胞至80%融合时进行实验。

1.4.2 MTT法检测细胞存活率 实验设空白对照组、模型组(MPP+)和HSYA组(15、60、120μmol/L)，每组设4个复孔，所用药物均用培养基稀释。将SHSY5Y细胞以1×104个/孔接种于培养板中培养24 h后，模型组直接加入1 mmol/L MPP+，HSYA组经药物预处理SH-SY5Y细胞1 h后再加入1 mmol/L MPP+，空白对照组则只加等体积培养基。药物孵育48 h后，每孔加入MTT(质量浓度为5 g/L)20μL，继续孵育。4 h后弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL，振荡数次，采用全自动酶标仪于570 nm处测定各孔的A值并计算细胞存活率。所有实验均重复5次。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡 将SH-SY5Y细胞以1×105个/孔接种于培养板中培养24 h后分别加入药物处理：模型组(1 mmol/L MPP+)，HSYA组(15、60、120μmol/L HSYA预处理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白对照组(加等体积培养基)。待药物作用48 h后，收集细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，按照Annexine V-FITC/PI试剂盒说明操作，采用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡率。

1.4.4 荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平将SH-SY5Y细胞以1×105个/孔接种于培养板中培养24 h后分别加入药物处理：模型组(1 mmol/L MPP+)，HSYA组(15、60、120μmol/L HSYA预处理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白对照组(加等体积培养基)。待药物作用48 h后，去除细胞培养液，加入10μmol/L DCFH-DA溶液1 m L后孵育20 min。重悬细胞，使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3遍，利用流式细胞仪检测其荧光强度值。

1.4.5 Rhodamine123染色法检测细胞线粒体膜电位将SH-SY5Y细胞以1×105个/孔接种于培养板中培养24 h后分别加入药物处理：模型组(1 mmol/L MPP+)，HSYA组(15、60、120μmol/L HSYA预处理1 h后再加入1 mmol/L MPP+)，空白对照组(加等体积培养基)。待药物作用48 h后，加入10μmol/L Rhodamine123染液1 mL后孵育30 min。重悬细胞，使用磷酸盐缓冲液洗涤细胞3遍，利用流式细胞仪检测其荧光强度值。

1.4.6 Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的表达 分别收集1 mmol/L MPP+、120μmol/L HSYA+MPP+和培养基作用48 h后的细胞，加入含有PMSF的RIPA裂解液160μL，冰浴30 min，待充分裂解后，高速冷冻离心机离心10 min (12 000 r/min，4℃)，胞浆蛋白Cyt-C离心60 min(20 000×g，4℃)，提取上清，并用BCA法对所提蛋白进行定量，规定上样量为40μg。Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9抗体稀释浓度均为1∶400，β-actin抗体稀释浓度为1∶4 000，其他处理均参照文献方法［9］。

1.5 统计学处理实验数据以均数±标准差()表示。所有数据均采用SPSS 15.0统计软件分析，并进行单因素方差分析(One-way ANVOA)，组间均数的多重比较使用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y细胞48 h后，细胞相对存活率仅为49.8%，与空白对照组比较呈显著性降低(P＜0.001)。而经HSYA(15、60、120 μmol/L)预处理1 h后，细胞存活率明显升高(P＜0.001)，并表现出一定的浓度依赖性。可见，HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞死亡(图1)。

图1 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig.1 Effect of HSYA on cell viability induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

2.2 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y细胞48 h后可明显诱导细胞凋亡，凋亡率为(38.6±1.8)%，与空白对照组的(1.2±0.01)%比较差异有统计学意义(P＜0.001)。而经HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1 h后，凋亡率明显降低(P＜0.01)，分别为(21.4± 2.1)%、(12.3±1.6)%和(6.3±1.1)%。可见，HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞调亡。

2.3 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞ROS含量的影响1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y细胞48 h后，与空白对照组相比，细胞内ROS含量明显增加，荧光强度显著增强(P＜0.001)；而经HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1 h后，与模型组比较，HSYA处理组荧光强度呈浓度依赖的减弱(P＜0.001，表1)。可见，HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞内ROS的增加。

表1 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞ROS含量的影响Tab.1 Effect of HSYA on ROS induced by MPP+in SHSY5Y cells(，n=5)

表1 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞ROS含量的影响Tab.1 Effect of HSYA on ROS induced by MPP+in SHSY5Y cells(，n=5)

Control：空白对照组；MPP+：模型对照组。与空白对照组比较，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

组别DCF荧光强度(%of control) Control 100.0±8.9 MPP+581.3±30.3###15μmol/L HSYA+MPP+445.6±44.5*60μmol/L HSYA+MPP+311.7±20.1**120μmol/L HSYA+MPP+180.2±19.6***

2.4 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y细胞48 h后，细胞线粒体膜电位显著性降低(P＜0.001)，荧光强度仅为空白对照组的(45.2±5.9)%；红/绿荧光强度比值由空白对照组的4.21±0.15降低为0.95±0.07。而经HSYA(15、60、120μmol/L)预处理1 h后，与模型组比较，HSYA处理组细胞线粒体膜电位呈浓度依赖的升高(P＜0.01)，红/绿荧光强度比值由模型组的0.95±0.07升高为1.87± 0.23、3.02±0.36和3.96±0.19(表2)。可见HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的降低。

表2 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响Tab.2 Effect of HSYA on mitochondrial transmembrane potential induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

表2 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响Tab.2 Effect of HSYA on mitochondrial transmembrane potential induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

Control：空白对照组；MPP+：模型对照组。与空白对照组比较，###P＜0.001；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

组别荧光强度(%of control)红/绿荧光强度比值Control 100.0±6.7 4.21±0.15 MPP+45.2±5.9###0.95±0.07###15μmol/L HSYA+MPP+64.4±9.1*1.87±0.23*60μmol/L HSYA+MPP+78.7±7.2*3.02±0.36**120μmol/L HSYA+MPP+90.2±8.6**3.96±0.19***

2.5 HSYA对SH-SY5Y细胞Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表达的影响如图2A所示，与空白对照组比较，1 mmol/L MPP+作用SH-SY5Y细胞48 h后，胞质Cyt-C释放明显增加(P＜0.01)，与模型组比较，120μmol/L HSYA预处理显著抑制Cyt-C的释放(P＜0.05)；MPP+诱导Bcl-2表达明显减少，Bax表达稍有增加，Bcl-2/Bax比值显著性减小(P＜0.01)；与模型组比较，120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值(P＜0.01，图2B)。MPP+能明显诱导SH-SY5Y细胞Caspase-3和 Caspase-9的高表达(P＜0.01，P＜0.05)；而120 μmol/L HSYA预处理能够有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞Caspase-3和Caspase-9表达的增加(P＜0.05，P＜0.05，图2C、2D)。

图2 HSYA对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9表达的影响Fig.2 Effects of HSYA on the expressions of Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 induced by MPP+in SH-SY5Y cells(，n=5)

3 讨 论

ROS诱发的线粒体凋亡途径被认为是细胞凋亡的主要途径之一［10］。在此过程中，ROS的堆积导致线粒体膜发生氧化受损并引起线粒体通透性转导孔开放，进而引起线粒体膜电位的降低，并引起核膜的破裂以及细胞色素及凋亡诱导因子等的释放［11-13］；进入胞质的细胞色素C可活化Caspase-9并进一步激活细胞凋亡过程中最关键酶Caspase-3从而触发凋亡级联反应［14-15］。Bcl-2主要存在于线粒体外层膜上，其抑制凋亡的机制是它可直接或者间接地阻止细胞色素C自线粒体的释出，从而抑制Caspase-9活化。Bax能与Bcl-2形成异源二聚体，通过抑制后者的活性，促进凋亡发生。一般认为Bcl-2/Bax比值越低，细胞越易发生凋亡［16-17］。

研究表明，MPP+可特异性的与线粒体呼吸链复合物I(MC-I)结合并抑制其活性，从而抑制ATP的合成，并导致线粒体受损，从而产生大量自由基，最终诱导细胞凋亡的产生［18-19］。目前，以MPP+诱导的细胞线粒体凋亡模型是研究药物对神经元凋亡保护作用的常用模型之一。

本研究参照程月发等人［20］的报道，采用MPP+诱导SH-SY5Y，发现1 mmol/L MPP+作用SHSY5Y细胞48 h后，能显著诱导细胞凋亡的发生，凋亡率达(38.6±1.8)%，而HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞调亡。文献报道，红花黄色素具有很强的抗自由基、抑制脂质过氧化作用［5-6］。大量文献显示，红花黄色素能显著降低氧化损伤脑组织的丙二醛含量和提高超氧化物歧化酶活性［7-8］。本实验结果显示，HSYA预处理能有效抑制MPP+诱导的SH-SY5Y细胞内活性氧的增加，我们认为这正是其抗氧化作用的结果。线粒体与Caspase蛋白酶家族被认为是凋亡过程中的两个重要的调控点。线粒体膜电位的崩解导致Cyt-C向胞质释放，并进一步激活Caspase蛋白酶是细胞凋亡中的核心事件［13］。本实验结果显示，HSYA能有效抑制MPP+诱导的细胞线粒体膜电位的降低、抑制Cyt-C向胞质释放和抑制Caspase-3和Caspase-9的高表达，可见，HSYA通过抑制线粒体膜电位的降低甚至崩解，减少了Cyt-C向胞质的释放从而抑制Caspase蛋白酶活化。同时，我们的结果显示，120μmol/L HSYA预处理能显著性增加Bcl-2/Bax比值，该结果和逯素梅等人的报道一致。而我们知道Bcl-2可通过作用于细胞色素C抑制Caspase蛋白酶活化［16］，因此我们不妨认为HSYA可能通过维持线粒体膜电位和增加Bcl-2的表达抑制Cyt-C向胞质的释放并最终抑制Caspase凋亡级联反应的发生。

总之，HSYA预处理能明显提高MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤的细胞存活率，可有效抑制细胞调亡的发生，其机制可能与抑制细胞线粒体凋亡途径有关。

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(编辑 卓选鹏)

Protective effects of hydroxysafflor yellow A against MPP+-induced apoptosis in SH-SY5Y cells

PAN Jian1，LI Shao-ping1，LI Jian-xiong2，LIAN Fo-yan3，HUANG Yan4，QIN Long4
(1.Emergency Center，2.Department of Neurology，3.Intensive Care Unit of Internal Medicine，4.Department of Pharmacy，Lanzhou University Second Hospital，Lanzhou 730030，China)

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effect of hydroxysafflor yellow A(HSYA)on MPP+-induced apoptosis in SH-SY5Y cells and its related mechanisms.MethodsCell viability was analyzed using MTT assay.Cell apoptosis was measured by flow cytometry.The level of reactive oxygen species(ROS)within the cells was analyzed by fluorometric probe DCFH-DA assay and mitochondrial transmembrane potential was revealed by rhodamine123 staining.The expressions of cytosolic Cyt-C，Bcl-2，Bax，Caspase-3 and Caspase-9 were analyzed by Western blot.ResultsThe cell viability was significantly decreased by 1 mmol/L MPP+，and the percentage of apoptosis increased to(38.6±1.8)%，but was reversed by HSYA pretreatment of different concentrations(15，60 and 120μmol/L)(P＜0.001，P＜0.01，respectively).Pretreatment of HSYA reversed the increase of ROS，cytosolic Cyt-C，Caspase-3 and Caspase-9(P＜0.001，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，respectively)，decrease of mitochondrial transmembrane potential and Bcl-2/Bax ratio induced by MPP+in SH-SY5Y cells(P＜0.01，P＜0.01，respectively).ConclusionHSYA pretreatment can increase cell viability to prevent MPP+-induced cell apoptosis.The mechanism may be correlated to the inhibition of mitochondrial apoptotic pathway.

hydroxysafflor yellow A；SH-SY5Y；apoptosis；mitochondrion

R285

A

1671-8259(2014)05-0690-05

10.7652/jdyxb201405025

2013-11-08

2014-01-25

中央高校基本科研业务费专项资金项目(No.LZUJBKY-2013-216) Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.LZUJBKY-2013-216)

秦龙，硕士.E-mail：lzviolin@163.com

潘剑(1958-)，男(汉族)，副主任医师.研究方向：神经损伤与药物防治.E-mail：ldeypj@163.com

时间：2014-05-16 15∶47 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140525.1243.001.html