胶质瘤细胞中miR-223对PAX6基因3'非翻译区的调控作用＊

罗奇志，邬力祥，文 芳，韩 仰，黄柏胜*

(中南大学湘雅医学院 a.免疫学系;b.生理学系，湖南 长沙 410078)

胶质瘤起源于胶质细胞或其前体细胞，是临床上常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，大约占颅内肿瘤的40%-50%，病人确诊后5年存活率少于3%［1，2］。胶质瘤具有高侵袭性，与邻近正常脑组织无明显分界，是构成其难治性的重要因素，导致手术治疗难以根除，常易复发、死亡率高。目前胶质瘤的常规治疗手段如手术切除、放疗、化疗效果并不满意［3］，经治疗后的患者的中位生存期仅有14个月左右［4］。因此，如何延长胶质瘤患者的存活期是我们目前正面临的紧迫问题。转录因子PAX6是进化上高度保守的PAX(Paired box)家族成员之一，与脑的发育有关，在脑中持久表达［5］。然而与邻近的正常组织相比，胶质瘤中PAX6的表达水平明显降低［6］，过表达PAX6可抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭［7，8］。近年来的研究使microRNA(miRNAs)已经迅速发展成为癌症和其它疾病的重要的潜在分子标志［9］。miRNAs属于一类18-22个碱基的、非编码的单链RNAs，它可以通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'-untranslation region，3'-UTR)特异性结合，引起靶基因mRNA降解和/或翻译受阻，在转录后水平调控基因的表达［10，11］。因此深入探讨胶质瘤中 PAX6表达下调的具体机制，有望为胶质瘤的治疗提供新思路。在本研究中，我们采用生物信息学软件在线预测可能与PAX63'-UTR相互作用的miRNAs，构建野生型和突变型PAX6基因3'-UTR双荧光素酶报告基因质粒，验证miR-223与PAX63'-UTR的靶向关系，为进一步研究miR-223对PAX6的调控作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM高糖培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，psiCHECKTM-2载体(Auragene公司)，Not I、Xho I内切酶和 T4连接酶(Fermentans公司)，DH5α感受态细胞(Auragene公司)，琼脂糖(西班牙Biowest公司)，质粒小提试剂盒(康为世纪公司)，DNA回收试剂盒(Omega公司)，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega公司)，1 kb DNA ladder、DS2000 DNA ladder(康为世纪公司)，miR-223 mimics(广州复能公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

胶质瘤细胞系(U251)购自中国科学院上海细胞生物学研究所，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养，每2～3天传代一次，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2.2 miRNA 靶点预测

应用 www.targetscan.org和 www.microrna.org在线生物信息学预测软件对人PAX63'-UTR可能作用的miRNAs进行预测分析，寻找调控PAX6的可能的miRNAs。

1.2.3 PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2、PAX6 Mut3'-UTR-psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因质粒构建

根据NCBI中人PAX63'-UTR基因序列(NM_001604)，采用Primer5.0软件进行引物设计，上游、下游引物5'端分别加入 Xho I、Not I酶切位点序列(下划线部分)，预计扩增产物大小为455 bp，引物序列如下:

以慢性粒细胞白血病K562细胞cDNA为模版，用以上引物扩增目的基因片段，将PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带，再用Xho I和Not I对回收的目的基因片段和psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因空载体同时进行过夜酶切16 h，将酶切产物电泳并回收酶切后的目的基因片段和psiCHECKTM-2双荧光素酶报告基因质粒，T4连接酶连接回收的目的基因片段和psiCHECKTM-2载体，室温连接2 h，连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，摇菌。

1.2.4 双荧光素酶报告基因重组质粒的鉴定

1.2.4.1 菌落PCR鉴定 以所构建的质粒为模板，用相应的引物扩增目的片段的全长或部分。挑取平板上长出的单个菌落重悬于10 μL LB培养液中，从中取1 μL做模板进行菌落PCR鉴定，扩增引物序列及扩增产物大小同1.2.3。

1.2.4.2 双酶切鉴定 用Xho I和Not I内切酶对抽提重组质粒进行双酶切，切出两条带，一条是原载体psiCHECKTM-2，另一条为目的片段，与用相同引物从基因组中扩增出来的片段大小相同。

1.2.4.3 测序鉴定 测序可以识别出扩增过程中出现的碱基突变等情况，将菌落PCR鉴定和双酶切鉴定均正确的样品送武汉华大基因进行双向测序。

1.2.5 质粒共转染U251细胞

取对数生长期的U251细胞，在转染前1天按照每孔5×105个细胞接种于24孔培养板中，转染时细胞密度大约为60%～70%;利用脂质体lipofectamine2000进行共转染miR-223 mimics和双荧光素酶重组质粒至U251细胞。按照以下实验分组进行:①转染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2双荧光素酶质粒组(NC组);②共转染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2+miR-223 mimics组(PAX63'-UTR+miR-223);③转染PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2双荧光素酶质粒组(NC组);④共转染 PAX6 Mut 3'-UTR-psi-CHECKTM-2+miR-223 mimics组(PAX6 Mut 3'-UTR+miR-223)。每组实验样本3个复孔，转染48 h后进行荧光素酶活性检测。

1.2.6 荧光素酶报告基因活性检测

应用Promega公司双荧光素酶报告基因系统检测转染后各组细胞的荧光素酶报告基因活性。按试剂盒说明书操作如下，弃原细胞培养液，用1×PBS清洗待转染的细胞两次，每孔细胞加入20 μL 1×PLB裂解液裂解细胞，室温振荡裂解细胞15分钟，收集细胞裂解液。加入100 μL LARⅡ工作液，快速混匀后，检测萤火虫荧光素酶活性值;然后加入100 μL Stop溶液，快速混匀后，置入发光检测仪中，检测海肾荧光素酶活性值;取测定的3个复孔的平均值计算相对荧光值。按照以下公式计算:相对荧光值=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 PAX6 mRNA靶向miRNAs的预测结果

通过生物信息学的预测软件，分析miR-223与其靶基因的结合情况，两个在线软件预测结果均显示PAX6的3'-UTR区有7个碱基(AACUGAC)能够与miR-223的“种子区”的碱基(UUGACUG)存在互补配对，该两个网站的预测结果均提示PAX6可能是miR-223的靶基因。(图1)。

图1 PAX6基因3'-UTR的miRNAs靶点预测Fig.1 Prediction result of miRNAs targeting PAX6 gene 3'-UTR

2.2 PAX63'-UTR 及 PAX6 Mut 3'-UTR 的 PCR扩增琼脂糖凝胶电泳

以K562细胞cDNA为模板，PCR扩增PAX63'-UTR和PAX6 Mut 3'-UTR，经1%琼脂糖凝胶电泳跑胶后，结果可见扩增产物条带大小为455 bp，与预期的扩增产物大小一致(图2)。

2.3 psiCHECKTM-2双荧光素酶载体双酶切的琼脂糖凝胶电泳

psiCHECKTM-2载体购自Auragene公司，分别用Not I/Xho I双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳结果如下(图3)。

2.4 双荧光素酶重组质粒的鉴定

2.4.1 菌落PCR 鉴定

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，1-6号孔为PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2 克隆检菌，其中 1、2、3、4、6 号孔为阳性，扩增条带大小与预计产物455 bp一致，5号孔为阴性;7-14号孔为PAX6 Mut3'-UTR-psi-CHECKTM-2克隆检菌，其中 7、9、10、13 号孔为阳性，扩增条带大小亦与预计产物455 bp一致，8、11、12、14号孔为阴性(图4)。

图2 PAX63'-UTR和PAX6 Mut 3'-UTR的PCR扩增Fig.2 PCR amplification of PAX63'-UTR and PAX6 Mut 3'-UTR

图3 psiCHECKTM-2载体的双酶切鉴定Fig.3 Double-enzyme digestion of psiCHECKTM-2 vector

图4 双荧光素酶重组质粒的菌落PCR鉴定Fig.4 Identifying dual luciferase recombinant plasmid by colony PCR

2.4.2 双酶切鉴定

双荧光素酶重组质粒经Not I/Xho I双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳图可见有两条条带，由图5可见，其中一条条带与psiCHECKTM-2空载体大小6273 bp一致，另一条条带为插入的目的片段，大小与455 bp相同，说明双荧光素酶重组质粒构建成功。

2.4.3 重组质粒的测序鉴定

将菌落PCR鉴定和双酶切鉴定均正确的双荧光素酶重组质粒送武汉华大基因公司进行测序，测序结果证实插入片段是PAX63'-UTR、PAX6 Mut3'-UTR序列，且与模板序列比对无点突变，质粒部分测序峰图如下(图6)。

2.5 miR-223与PAX63'-UTR靶向关系分析

在生物信息学软件在线预测PAX6为miR-223靶基因的基础上，为了进一步验证miR-223是否能够靶向结合PAX63'-UTR，我们将PAX63'-UTR-psi-CHECKTM-2质粒和PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2质粒与miR-223 mimics分别共转染至U251细胞，应用双荧光素酶报告基因系统检测转染后各组细胞的荧光素酶报告基因活性，检测结果如图7所示。与单一的质粒转染组相比，miR-223 mimics能明显降低PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2的荧光素酶活性，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果提示miR-223与PAX6基因3'-UTR区存在靶向作用关系，它能够靶向负性调节PAX63'-UTR。

图5 双荧光素酶重组质粒经Not I/Xho I双酶切鉴定Fig.5 Enzyme digestion of the dual luciferase recombinant plasmid

图6 双荧光素酶重组质粒的序列测定Fig.6 The sequencing map of dual luciferase recombinant plasmid

3 讨论

胶质瘤是常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，因它具有独特的侵袭性而难以治疗，因此寻找脑胶质瘤新的治疗靶点具有重要意义。研究报道，与邻近的正常组织相比，胶质瘤中PAX6的表达水平明显降低［6］。目前认为，PAX6在胶质瘤的发生发展过程中是一种抑制性调控因素，过表达PAX6能抑制胶质瘤细胞的生长和侵袭［7，8］。因此深入探讨胶质瘤中PAX6表达下调的确切机制，有望为明确胶质瘤的侵袭性指明新思路。

图7 胶质瘤U251细胞中双荧光素酶活性分析Fig.7 Analysis of the reporter activities in U251 cells

miRNAs属于一类小的、非编码的单链RNA，它可以通过与靶基因mRNA的3'-UTR结合，引起靶基因mRNA降解或翻译受阻，从而在转录后水平调节蛋白的表达。miRNAs具有多种生物学作用，它作为抑癌基因还是致癌基因取决于它们相关靶基因的功能。随着人们对miRNAs的基本特征、生物学功能等的进一步了解，发现miRNAs能够通过调节下游基因的表达和功能从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动［9］。另外一些特异性的miRNAs在胶质瘤中的表达水平异常或发生突变，且影响胶质瘤的增殖、凋亡及侵袭转移，提示miRNAs的异常表达与胶质瘤密切相关，很多miRNAs的靶基因就是抑癌基因或致癌基因。目前已经将miRNAs作为胶质瘤临床诊断的生物学标志以及最有潜力的治疗靶点之一［12，13］。相关的研究也证实了一些 miRNAs在胶质瘤形成、生长、增殖、侵袭和转移等方面起到重要的调控作用。作为癌症重要调节因子的miRNAs给我们带来了治疗胶质瘤的新希望［1，14，15］。

有研究报道miRNAs作为肿瘤抑制基因或致癌基因取决于它作用的靶基因的功能，如miR-223作为致癌基因或肿瘤抑制基因与癌症的不同类型有关，在不同类型的癌症或肿瘤细胞中miR-223靶向不同或相同的基因而呈现不同的作用［16-20］。例如，它可以通过靶向Hsp90B1而抑制骨肉瘤的生长［16］;miR-223在结肠直肠癌HCT116细胞、宫颈癌Hela细胞和肝癌HuH7细胞中低表达，而过表达miR-223可以通过靶向FOXO1而抑制上述三种癌细胞的增殖［17］。但miR-223在胃癌细胞中高表达，它作为致癌基因通过靶向结合肿瘤生长抑制基因EPB41L3［18］的3'-UTR，在转录后水平下调靶基因的表达，与癌细胞的转移有关，或者抑制FBXW7/hCdc4［19］的表达而促进胃癌细胞的增殖和侵袭。在乳腺癌细胞中，miR-223通过Mef2c-b-catenin信号通路，提高癌细胞的侵袭能力［21］。另外在胃癌中miR-223靶向抑制stathmin1的表达而发挥致癌作用［20］，然而在胶质瘤中miR-223的生物学功能目前还不清楚。此外，与PAX6相关的miRNAs的报道非常少见［22］，在胶质瘤中，靶向调节PAX6的miRNAs尚需要进一步实验证实。

随着对miRNAs研究的不断深入，miRNAs靶基因预测的生物信息学软件迅速兴起，研究者根据已知miRNAs及其靶基因mRNA之间的某些序列特征制定不同运算规则，开发出多种软件进行miRNAs靶基因的预测。在本研究中，我们选用了两个比较权威的在线软件 Targetscan 5.1和 Microrna预测了PAX6基因3'-UTR可能的靶向miRNAs。本实验中，生物信息学软件在线预测结果显示，miR-223与PAX6基因3'-UTR能够不完全互补结合，可能对PAX6基因具有靶向调节作用。据此，我们构建了野生型PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2和突变型PAX6 Mut 3'-UTR-psiCHECKTM-2双荧光素酶重组质粒，并将该质粒分别与miR-223 mimics共转染U251细胞，实验结果显示，共转染PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2重组质粒和miR-223 mimics的细胞样本中，荧光素酶活性强度相比其它组显著下降，miR-223 mimics显著地抑制了野生型PAX63'-UTR-psiCHECKTM-2荧光素酶报告基因的活性，miR-223能识别PAX63'-UTR序列而使报告基因荧光素酶活性下降(P＜0.05)，说明miR-223与PAX6基因3'-UTR区存在靶向作用关系;该实验初步证实了miR-223能够与PAX63'-UTR靶向结合，并能够负性调节PAX6的表达，但仍需要进一步在mRNA和蛋白水平给予验证。

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