电针对兔腰肌急性钝挫伤后组织修复与碱性成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶信号通路的影响①

陈欢，彭博，李富运，于雪，卢虎英，卫肖艳，彭园园，范伊凡，张莉

电针对兔腰肌急性钝挫伤后组织修复与碱性成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶信号通路的影响①

陈欢1，彭博1，李富运1，于雪2，卢虎英3，卫肖艳1，彭园园1，范伊凡1，张莉1

目的 观察电针对兔腰肌急性钝挫伤后碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、结蛋白(Desmin)以及细胞外信号调节激酶(ERK1/2)表达的影响，探讨电针对兔腰肌损伤后组织再生修复影响的可能机制。方法40只雄性新西兰大耳兔随机分为空白组、模型组、电针委中组、电针局部组，每组10只。采用钝挫伤方法造成兔腰肌损伤模型并对各组动物进行外表观察评分。造模后电针治疗2周，HE染色观察腰肌组织形态改变，免疫组化染色观察腰肌bFGF的表达，Western blotting法检测腰肌Desmin与ERK1/2蛋白表达。结果模型组、电针委中组与电针局部组外表观察评分均明显高于空白组(P＜0.01)。组织形态学评分由高到低依次为模型组、电针局部组、电针委中组、空白组(P＜0.05)，腰肌bFGF的表达依次为电针局部组、电针委中组、模型组、空白组，Desmin的表达为电针局部组=电针委中组、空白组=模型组(P＜0.05)，ERK1/2的表达为电针局部组=电针委中组、模型组、空白组(P＜0.05)。结论电针可能通过上调bFGF/ERK信号通路的表达，促进兔腰肌急性钝挫伤后的组织修复。

腰肌急性钝挫伤；电针；委中；碱性成纤维细胞生长因子；结蛋白；细胞外信号调节激酶；兔

[本文著录格式]陈欢，彭博，李富运，等.电针对兔腰肌急性钝挫伤后组织修复与碱性成纤维细胞生长因子/细胞外信号调节激酶信号通路的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(3):215-220.

“腰背委中求”是指导针灸临床的经典理论依据之一。临床经验与实验研究均表明，委中穴(BL40)对腰背部疾病具有很好的疗效[1-2]。电针阿是穴能够促进骨骼肌损伤后肌肉的再生与修复，并且与上调碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的表达有关[3]。bFGF激活的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路是调节细胞增殖与分化的主要细胞外信号通路之一[4-5]。本研究观察电针委中穴与局部对损伤组织的再生修复作用，以及对bFGF/ERK信号通路的影响，探讨委中穴对腰背部疾病的作用机制，以期揭示“腰背委中求”的部分科学内涵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性新西兰大耳兔40只，体重2.0～2.5 kg，由北京市兴隆实验动物养殖厂提供，许可证号：SCXK(京)2011-0006。

1.1.2 仪器 G6805-1电针治疗仪：青岛鑫升实业有限公司。RM2235石蜡切片机：德国LEICA MICROSYSTEMS公司。DH-101电热恒温鼓风干燥箱：北京利康科技发展有限公司。BX43显微镜：日本OLYMPUS公司。Mshot MC50显微成像系统：广州市明美科技有限公司。Thermo Scientific Forma 907超低温冰箱：THERMO SCIENTIFIC公司。Sigma®3K30高速离心机：SIGMA公司。3 ml、5 ml玻璃匀浆器：海门弘澄实验器材制造有限公司。FA1004N电子天平：上海精密科学仪器有限公司。SPX型智能生化培养箱：宁波江南仪器厂。Bio-Rad®蛋白质电泳及转膜系统：BIO-RAD公司。IKA®RH Basic 1恒温磁力搅拌器：IKA公司。TS-1摇床：北京泰亚赛福科技发展有限责任公司。Tecan®Austria GMbH全波长多功能酶标仪：TECAN公司。Alpha Innotech®Fluor Chem FC2凝胶成像系统：ALPHAINNOTECH。

1.1.3 试剂 兔多抗FGF-2抗体、兔多抗ERK1/2抗体、兔多抗结蛋白(Desmin)抗体、鼠多抗GADPH抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠HRP二抗：北京博奥森生物技术有限公司。通用型二抗、DAB显色剂：北京中杉金桥生物技术有限公司。E040252 MarkerⅠ：EarthOx公司。RIPA裂解缓冲液、蛋白定量试剂盒、PVDF膜：北京普利莱基因技术有限公司。Pierce ECL蛋白印迹发光底物：THERMO公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 按随机数字法分为空白组、模型组、电针委中组、电针局部组，每组10只。

1.2.2 动物造模 模型组、电针委中组、电针局部组适应性喂养后，20%乌拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉。麻醉后固定于兔台上，剪除第5腰椎水平两侧腰部被毛，面积约为4×4 cm，用48 cm高的导向筒固定高度和打击点，以500 g砝码从导向筒中自由落下，重力势能为2.352 J，反复30次，损伤面的面积约2×2 cm，依次造成双侧腰肌急性钝挫伤[6]。造模完成后10 min，观察左右侧局部外表形态学变化并进行外表观察评分[7](表1)。取两侧平均值。

表1 外表观察评分标准

1.2.3 处理方法 ①空白组：不做任何处理。②模型组：与电针委中组、电针局部组同步抓取与固定，不做治疗；③电针委中组：参照《实验针灸学》常用实验动物穴位图谱选取委中穴，0.25×13 mm一次性针灸针(中研太和)，接电针治疗仪，频率2/10 Hz疏密波，电流1～2 mA，持续20 min，每天1次，每周6次，共2周。④电针局部组：以打击病损中心为电针作用点，刺激参数同电针委中组。造模后第2天开始治疗。

1.2.4 取材 造模治疗2周后，各组动物20%乌拉坦溶液5 ml/kg腹腔注射麻醉。无菌操作，剔除皮毛、筋膜，暴露分离出下腰部肌肉，锐性切取左侧第5腰椎水平病灶组织，宽、厚约1.5 cm。置4%多聚甲醛溶液固定；锐性切取右侧第5腰椎水平的病灶组织，迅速转移至2 ml冻存管并投入液氮罐中快速降温，转移至-80℃冰箱保存，待测。

1.2.5 HE染色 4%多聚甲醛溶液固定48 h以上，石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下(200×)利用无偏体视学(unbiased stereology)技术，全视野无偏采样方法每张切片选取6个视野，进行组织形态学评分[7](表2)。

表2 组织形态学评分标准

1.2.6 免疫组化染色 65℃烤片6 h，常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水，双蒸水冲洗以封闭内源性过氧化氢酶，冲洗、热修复抗原，PBS冲洗封闭，4℃孵育14 h，加Ⅰ抗、Ⅱ抗，DAB显色，显微镜下观察，出现棕黄色后即把切片放入自来水中终止反应。自来水冲洗，苏木素复染，盐酸酒精、氨水返蓝，脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察、采集图像，采用Image-professional Plus 6.0软件进行图像分析。光镜下(200×)利用无偏体视学技术，全视野无偏采样方法每张切片选取7个视野，测量每个视野中bFGF阳性表达区域的平均光密度值(mean optical density, MOD)，取平均值为该样本MOD值。

1.2.7 Western blotting 取好的组织分别置于2 ml蛋白裂解液中低温匀浆。12,000 r/min 4℃离心10 min，取上清液。取上清液10 μl，BCA法测蛋白含量(参照试剂盒说明进行)，绘制标准曲线。在样品中按4∶1加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5 min后放入冰中迅速降温。SDS-PAGE电泳：每孔上样10 μl(含蛋白液2 μl)，最后留1孔加入Marker 8 μl，接通电泳装置，100 V，48 mA电泳约90 min，以肉眼观察溴酚蓝条带距胶底1 cm左右停止电泳。根据目标蛋白ERK1/2 (42 kDa)与Desmin(52 kDa)分子量，按Marker条带分布切取需要电转的胶。在转移缓冲液中，按从负极面到正极面，按海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵的顺序重叠，移入已置有冰盒的转移缓冲液中，以100 V电压冰浴中电转75 min。PBST洗膜10 min，共3次，加入封闭液37℃摇床封闭90 min。PBST洗膜10 min，共3次，加入一抗(PBS溶液1∶300稀释)，室温孵育90 min；PBST洗膜10 min，共3次，加入二抗(PBS溶液1∶10000稀释)，室温孵育60 min；PBST洗膜10 min，共4次。将ECL底物显色A、B液以1∶1混合，膜正面向上，加入混合液室温反应正面2 min，背面30 s，放进胶片夹中曝光，X光片置于显影液显影，最后置于定影液中定影。

内参GADPH的蛋白印记：将完成ERK1/2与Desmin蛋白印记的膜PBST洗膜10 min，共3次，再置于膜再生液中再生20 min，PBST洗膜5 min，共2次。抗原抗体反应过程中GADPH以PBS溶液1∶500稀释，二抗以PBS溶液1∶8000稀释。

X光片采用Alpha Innotech®Fluor Chem FC2凝胶成像系统进行图像采集，使用AlphaEasy FC软件对图像进行定量分析，计算每个样本的ERK1/2、Desmin与GADPH的光密度比值(IDV)。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理。各组数据以(±s)表示。组间采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，两两比较用LSD-t检验。显著性水平α1=0.05，非常显著性水平α2=0.01。

2 结果

2.1 外表观察评分

造模后模型组、电针委中组与电针局部组之间外表观察评分无显著性差异(P＞0.05)，并均明显高于空白组(P＜0.01)。见表3。

表3 兔腰肌外表观察评分

2.2 组织形态学变化

空白组：肌细胞呈规则多边形，大小均匀，排列整齐，肌纤维间隙大小一致，细胞核位于细胞边缘，且每个肌细胞可见到几个细胞核排列。模型组：肌细胞形状、大小不规则，排列不齐，损伤局部出现大量结缔组织增生，以及少量细胞核位于中心的新生的肌细胞。电针委中组：肌纤维排列较模型组整齐，肌细胞稍肿胀，可能与肌细胞再生分化有关，结缔组织增生程度较模型组轻。电针局部组：肌纤维排列较模型组整齐，中心核的新生肌细胞较多，肌细胞体积略小于电针委中组，可见轻度结缔组织增生现象。见图1。

模型组组织形态学评分明显高于空白组，电针委中组与电针局部组评分明显低于模型组(P＜0.01)，电针委中组低于电针局部组(P＜0.05)。见表4。

表4 兔腰肌组织形态学评分

2.3 bFGF

空白组：bFGF呈浅黄色的弱阳性表达，略高于背景，分布均匀。模型组：骨骼肌损伤局部出现黄色的bFGF阳性表达。电针委中组：bFGF呈棕色的强阳性表达。电针局部组：bFGF呈棕色的强阳性表达，与电针委中组比较表达强度相当，但阳性表达面积较多。见图2。

图像分析显示，模型组bFGF表达明显高于空白组(P＜0.01)，电针委中组与电针局部组明显高于模型组(P＜0.01)，电针局部组明显高于电针委中组(P＜0.01)。见表5。

2.4 Desmin

模型组腰肌Desmin表达与空白组无显著性差异(P＞0.05)，电针委中组和电针局部组的表达均高于空白组(P＜0.05)和模型组(P＜0.05)，电针委中组与电针局部组无显著性差异(P＞0.05)。见表6。

2.5 ERK1/2

模型组腰肌ERK1/2的表达高于空白组(P＜0.05)，电针委中组和电针局部组的表达均高于空白组(P＜0.01)和模型组(P＜0.05)，电针委中组与电针局部组间无显著性差异(P＞0.05)。见表7。

表5 兔腰肌bFGF的表达

图1 各组兔腰肌组织形态学变化(HE染色，200×)

图2 各组兔腰肌bFGF表达(免疫组化，200×）

表6 兔腰肌Desmin表达

表7 兔腰肌ERK1/2表达

3 讨论

《灵枢》“以痛为腧”的思想被广泛应用于治疗各种急慢性筋伤、筋损病症。针刺局部阿是穴能够改善骨骼肌损伤后肌原纤维和肌节的排列，抑制组织纤维化，促进组织形态学的恢复[8-9]。

“经脉所过，主治所及”是远端循经取穴的理论依据。远端腧穴能够通过疏通经络，运行气血对经脉所过部位产生濡养作用。

委中穴是足太阳膀胱经的合穴，腰背部为膀胱经循行之要道。委中穴与腰背部组织存在神经特异性联系，对腰背部疾病疗效显著[1-2]。本研究结果显示，与模型组比较，电针局部组和电针委中组肌纤维排列均较整齐，肌细胞大小形态较规则，并且可见较多新生的肌纤维，结缔组织增生现象较轻，组织形态学评分显著高于模型组，组织修复程度优于模型组。电针委中组的病灶区域少于电针局部组，肌细胞体积较大；电针局部组可见较多新生肌细胞，提示电针局部组部分病灶仍处于肌细胞再生阶段，而电针委中组已进入成肌分化阶段。组织形态学评分显示电针委中组优于电针局部组。提示在急性钝挫伤中，远端循经取穴能较好促进损伤组织形态的恢复。这可能是因为远端穴位刺激除了能够较好维持损伤腰肌的局部制动，同时又能够疏经通络，调理气血，调节经脉循行之处腰背部组织的代谢，从而对损伤修复产生较好的调节作用。

Desmin是一种肌肉特异性中间丝蛋白，在骨骼肌成肌分化过程中较早表达[10]。Desmin在正常肌纤维中有分布；肌肉损伤后由于骨架蛋白的缺失，导致Desmin表达迅速下降；随着肌卫星细胞再生分化为具有肌肉特性的肌纤维后，Desmin表达增加，随后可逐渐回落到正常水平或造成永久缺失[3,11]。骨骼肌损伤后经历坏死/炎症、修复与重塑3个病理阶段，损伤后第2周处于组织修复高峰期[12-13]。本研究结果显示，此时模型组Desmin表达与空白组无显著性差异，结合组织形态学结果，此时模型组正处于组织再生修复阶段；电针委中穴与电针局部均能够促进兔腰肌钝挫伤后再生肌细胞向成肌分化。

促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)是哺乳动物体内维持细胞生长、增殖、分化、存活以及先天免疫的一系列重要细胞内信号通路[14]。ERK1/2是MAPK信号通路中的一个子通路，具有调节细胞有丝分裂和促有丝分裂的功能，在促进细胞增殖、分化与转化中发挥主要作用[15]。

bFGF是一类对成纤维细胞系Balb/c3T3的分裂增殖具有促进效应的多肽，对骨骼肌损伤后肌卫星细胞的激活与成肌分化具有较好的促进作用[16-17]。骨骼肌损伤后，由于肌细胞膜破裂，bFGF释放到病灶局部[18]；另一方面，机体损伤信号的刺激可上调bFGF的分泌，从而共同参与肌细胞的再生与分化。bFGF受体属于RKT家族，能通过Ras/Raf-1/MEKs级联途径激活ERK1/2信号通路，从而促进肌卫星细胞的细胞增殖与分化[4-5]。

本研究结果显示，兔腰肌钝挫伤2周后，腰肌bFGF与ERK1/2的表达均出现上调；电针委中穴与电针局部均能使机体bFGF与ERK1/2的表达增加，其中电针局部组腰肌bFGF的表达高于电针委中组，这可能与电针对肌纤维的直接牵拉有关。虽然电针局部组bFGF表达高于电针委中组，但是组织形态学恢复却不如电针委中组。邵素霞等发现，在一定范围内随着bFGF浓度的增加，体外培养的骨骼肌卫星细胞的增殖能力有所上升，但是这种促进能力并不随着浓度的持续上升而无限增大，bFGF在促进离体肌卫星细胞增殖存在着一个最佳浓度范围[19]。机体局部分泌的bFGF对促组织修复可能也存在一个最佳浓度范围。

兔腰肌钝挫伤后会产生组织的再生与修复，损伤局部的骨骼肌可能通过bFGF的自分泌，激活ERK1/2信号通路，从而促进骨骼肌的自我修复。电针委中穴与电针局部均能够促进兔腰肌钝挫伤后的组织再生与修复，其机制可能与上调bFGF/ERK信号通路的表达有关。

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Effects of Electroacupuncture on Morphology Repairment and Basic Fibroblast Growth Factor/Extracellular Signal-regulated Kinase Signal Pathway of Rabbits with Acute Lumbar Muscle Contusion

CHEN Huan,PENG Bo,LI Fu-yun,et al.Acupuncture Moxibusion and Tuina School,Beijing University of Chinese Medcine,Beijing 100029,China

ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture on basic fibroblast growth factor(bFGF),Desmin and extracellular signal-regulated kinase(ERK1/2)expression of rabbits with acute lumbar muscle contusion,and discuss the possible mechanism of muscle tissue regeneration and repair.Methods40 male New Zealand rabbits were randomly divided into blank group(BG,n=10),model group (MG,n=10),Weizhong(BL40)electroacupuncture group(WG,n=10)and local electroacupuncture group(LG,n=10).Lumbar muscle injury was established with blunt trauma,and the rabbits were assessed with Appearance Score.The WG and LG accepted electroacupuncture for 2 weeks after modeling.The lumbar muscle of each animal was stained with HE to observe pathological changes,and immunohistochemical staining was used to observe bFGF expression,and Western blotting was used to detect the expression of Desmin and ERK1/2 protein.ResultsAppearance Score was more in the MG,WG and LG than in the BG(P＜0.01).Histological score ranked from more to less as MG, LG,WG and BG(P＜0.05).The expression of bFGF ranked as LG,WG,MG and BG(P＜0.01),Desmin ranked as WG=LG and BG=MG(P＜0.05),ERK1/2 as LG=WG,MG and BG(P＜0.05).ConclusionElectroacupuncture could promote the regeneration and repair of tissue after acute lumbar muscle contusion,which may be related to the up-regulation of bFGF/ERK signaling pathway.

lumbar acute contusion;electroacupuncture;BL40;basic fibroblast growth factor;Desmin;extracellular signal-regulated protein kinase;rabbits

R685.4

A

1006-9771(2014)03-0215-06

2013-08-09

2013-10-08)

1.国家自然科学基金项目(No.81141120)；2.高等学校博士学科点专项科研基金项目(No.20110013110014)。

1.北京中医药大学针灸推拿学院，北京市100029；2.北京中医药大学基础医学院科研实验中心，北京市100029；3.中国康复研究中心，北京市100068。作者简介：陈欢(1984-)，女，福建漳州市人，博士研究生，主要研究方向：针灸临床机理研究。通讯作者：张莉，女，博士，教授，博士生导师。

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.03.004