典型水污染区环境样品的去甲基化表观遗传毒性初步研究

朋玲龙,杨永坚,王先良,王菲菲,吕占禄,钱岩,满江红

1.安徽医科大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生系,安徽230032

2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,北京100012

环境污染物不仅可以通过损伤人体的遗传物质导致基因序列改变或染色体畸形,影响重要功能性蛋白的表达进而产生各种健康损伤效应,还可以通过改变受体重要基因启动子区的甲基化水平来调节功能性蛋白的表达,进而产生肿瘤等各种不良效应,也就是说污染物可以通过下调/上调基因启动子区DNA甲基化水平影响关键基因表达进而产生人体健康损害[1-3]。当一种化合物可以导致人类受体DNA中基因启动子区甲基化水平等化学修饰改变,但不伴有基因突变等其他遗传物质损伤时,就可以被认为是一种表观遗传毒物[4]。研究发现,环境中存在这样一大类化学物质,目前被认为是无毒或无害的,却通过调节DNA甲基化水平对人类产生潜移默化的深远影响[5],因此,评估化学污染物去甲基化能力是化学品安全性评价的新问题,有专家已经开始认识到定量检测去甲基化表观遗传毒性重要性[6-7],但目前为止还没有形成比较成熟的方法。

DNA甲基化通过调控基因表达在污染物毒性损害过程中扮演重要角色。不管是体内实验还是体外实验,了解化学物对于人类甲基化水平的作用,可以为评估化学物潜在毒性提供更全面的评价信息。近几年研究显示,暴露于重金属等可引起DNA甲基化的改变,如长期低浓度砷暴露所致健康损害与其导致受体遗传物质DNA去甲基化等表观遗传机制有密切联系[8]。另外镍、铬的毒性也与表观遗传调控密切相关[9]。而环境样品如地表水、地下水以及土壤等都含有这类物质,那么我们考虑环境样品是否也具有去甲基化表观遗传毒性,因此选取淮河流域局部癌症发病关注地区采集的地表水、地下水、土壤和底泥样品为代表性环境样品,以其中的2个地表水、3个地下水、2个土壤、2个底泥样品重金属提取液为测试样,通过EGFP方法[10]检测其去甲基化表观遗传毒性,评价结果以去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)的浓度当量表示,5-Aza-CdR是医学上明确的具有较强去甲基化能力的药物[11]。该方法是基于EGFP报告基因的分子生物学构建,采用高甲基化的EGFP报告基因受试细胞重组载体,以此为基础采用评价去甲基化能力的健康风险评价新方法,是对污染物表观遗传毒性评价技术的新探索。同时通过电感耦合等离子体质谱法(ICP/MS)[12]对提取液的成分进行扫描检测分析,探索影响样品综合去甲基化能力的主要组成成分。环境样品中具有去甲基化能力的物质很多,前期研究显示采集样品地区存在一定程度的重金属污染,如Cd、Mn,故这次在探索影响样品综合去甲基化能力的主要组成成分时只针对重金属成分。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

主要仪器:STD型冷冻干燥机(FTS公司,美国);FED115型电子烘箱(Binder公司,德国);漩涡振荡器(赛唯斯科技公司,中国);Agilent 7500c型电感耦合等离子体质谱仪(安捷伦公司,美国);水平电泳仪(Biometra,德国);凝胶成像系统(Vilberlo urmat,法国);PCR仪(Biometra,德国);高速离心机(Sigma 3K30,Sigma,美国);流式细胞仪(Bechman Coμlter Altra,美国);CO2培养箱(Thermo,美国)。

主要试剂:HNO3优级纯;大肠杆菌感受态细胞、pEGFP-C3质粒由北京工业大学杨怡姝教授馈赠;HepG-2细胞由协和细胞库提供;Plasid maxi kit试剂盒(QIAGEN,美国);DNA Fragment Purification KitVer.2.0(TaKaRa,中国);CpG甲基化酶(M.SssⅠ),核酸内切酶 HpaⅡ,EcoRⅠ,ApaLⅠ,MspⅠ(New England Biolabs公司,美国);T4 DNA ligase(New England Biolabs,美国);RNeasy Mini Kit试剂盒(QIAGEN,美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 环境样品的预处理

地表水、地下水、土壤、底泥等环境样品均按照标准操作采样,4℃运输和保存。具体点位信息见表1。

水体样品的前处理方法:取1 mL的水样,滤膜过滤后直接烘干,再加纯水1 mL定容,以该溶液为测试样分别进行去甲基化毒性测试和ICP/MS检测;土壤和底泥样品前处理方法:将土壤和底泥自然风干,后研磨成细粉。取1 g的土壤和底泥细粉分别加入10 mL的10%稀硝酸溶液,漩涡振荡器混匀3 min,过滤收集滤液,烘干后加入纯水1 mL定容,以该溶液为测试样分别进行去甲基化毒性测试和ICP/MS检测。

1.2.2 环境样品去甲基化表观遗传毒性检测

环境样品表观遗传毒性检测方法参照文献[10]采用EGFP方法,该方法主要研究化学物去甲基化能力方面的综合表观遗传毒性,基本原理为将pEGFP-C3质粒通过人工甲基化处理获得荧光蛋白基因启动子区处于高甲基化状态的C3质粒,并将其转染进人类HepG-2肝癌细胞株,随后以该改造细胞株(EGFPHepG2)为主要工具载体,与受试化学物进行共培养,依据细胞绿色荧光强度来定量评价化学物的去甲基化功能的强弱。

其主要步骤如下:

(1)C3质粒大量制备与甲基化处理

依据常规方法扩增环状C3质粒,借助核酸内切酶ApaL I和EcoR I双酶切将C3质粒切割为长片段L和短片段S,其中短片段S中含有GFP蛋白基因的启动子序列,利用甲基化酶MSss.Ⅰ对短片段S进行人工甲基化处理[13]。反应体系为:10×NE缓冲液2,4 μL;100 × SAM,4 μL;DNA(1.7 μmol·L-1),8 μL;M.SssⅠ,6 μL;ddH2O,18 μL;总量 40 μL;混匀,37 ℃,3 h 温育。产物 DNA 浓度为 0.36 μmol·L-1。65℃,20 min 灭活M.SssⅠCpG甲基化酶,分装冷藏保存。利用T4DNA连接酶把成功甲基化的C3质粒短片段S和长片段L重新连接成环,利用DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0对重组C3质粒进行纯化备用。

(2)甲基化C3质粒转染HepG-2细胞

快速将所冻存HepG-2细胞40℃水浴摇床60 r·min-1慢摇至其溶解,溶解后马上转入37℃水浴箱,手工慢摇恒温2～3 min复苏。复苏后800 r·min-1离心5 min,吸去上清加入10 mL含15%胎牛血清DMEM培养基,混匀后加入24孔细胞培养板,每孔0.5 mL,5%CO2温箱37℃培养。在丰度达到95% ～100%时在4个24孔板上进行细胞传代,24 h后细胞贴壁,依据说明书加入Fugene HD转染试剂和甲基化C3质粒进行转染[14]。

(3)改造细胞株(EGFPHepG2)与受试物进行共培养

转染6 h后,开始进行受试物染毒,受试物即在淮河流域局部癌症发病关注地区采集的2个地表水、3个地下水、2个土壤、2个底泥样品重金属提取液。并以5-Aza-CdR为阳性受试物进行细胞梯度剂量共培养染毒处理,通过预实验确定的梯度浓度为0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1,每个梯度设3 个平行孔,每孔依次加入相应梯度的应用液,以制作标准曲线。在染毒过程中为减小5-AZA应用液对细胞生长状态影响,配制的5-AZA 应用液的浓度分别为0.008、0.04、0.2、1 μmol·L-1,其培养的终体积为1 mL,故每孔只需加相应浓度的5-AZA应用液20 μL。

表1 环境样品具体点位信息Table 1 Information of the specific point of environmental samples

(4)共培养细胞绿色荧光检测

通过预实验发现共培养24 h后细胞可以稳定地发出较强的荧光,故对处理后的24孔板进行摄片,每孔随机取10个视野,拍摄10张荧光照片,摄片于半小时内完成。

(5)流式细胞仪荧光检测

拍摄完成后收集24孔板内细胞,加入200 μL消化液消化1 min,加入0.5 mL PBS吹打均匀,吸取到离心管中离心1 200 r·min-14 min,小心去上清液。1 mL PBS重悬细胞沉淀,轻轻吹打均匀,过300目滤网到流式专用管中,放入流式细胞仪测量检测,获取其荧光强度。

(6)样品重金属提取液去甲基化毒性评价

基于每个受试样品与细胞共培养后流式细胞仪检测数据,依据标准曲线对受试样品的去甲基化表观遗传毒性进行评价,每个受试样品取5个同步平行样,评价结果以5-Aza-CdR的浓度当量表示。

1.2.3 基于5-Aza-CdR染毒标准曲线的制作

对梯度终浓度为 0、0.00016、0.0008、0.004、0.02 μmol·L-1的5-Aza-CdR溶液对受试细胞体系进行了染毒处理,依据上述方案进行了流式荧光检测,每个浓度梯度设置4个平行测试样,同时设置了2个完全无甲基化的 C3质粒转染的对照细胞孔。以5-Aza-CdR溶液浓度为自变量,以荧光阳性细胞百分比为因变量进行拟合,得出甲基化能力测试曲线方程为y=0.136Ln(x)+7.691,其曲线拟合情况见图1。

1.2.4 环境样品重金属提取液成分检测

重金属提取液成分检测参照文献[12]采用电感耦合等离子体质谱法(ICP/MS)进行检测分析。

1.2.5 统计方法

数据采用SPSS for windows 10.0进行均数检验、相关分析等统计处理,细胞荧光图片处理采用Image-Pro Plus图像分析处理软件,曲线拟合采用Excel软件。

2 结果(Results)

2.1 不同样品测试组细胞荧光

通过荧光显微镜对染毒细胞进行摄片,发现不同样品组之间细胞存在明显的荧光差异,代表性荧光图如图2所示;流式细胞术定量检测显示不同样品的荧光强度也不同,代表性的绿色荧光流式细胞检测效果如图2所示。

图1 5-Aza-CdR染毒的标准曲线Fig.1 5-Aza-CdR exposure standard curve

图2 代表性显微镜绿色荧光摄片及流式细胞绿色荧光检测效果Fig.2 Representative radiograph by green fluorescence and detection effect on green fluorescence of flow cytometry

2.2 环境样品的表观遗传毒性检测结果

通过检测,发现在9个测试样中,有7个显示出可以观察到的去甲基化表观遗传毒性,占测试样品78%。其去甲基化表观遗传毒性当量介于0.065～0.257 μmol·L-1的 5-Aza-CdR 之间。来自安徽宿州涌桥的一个底泥样品毒性最高,毒性当量为0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR;并且其一个地下水样品的毒性较高,毒性当量为 0.142 μmol·L-1的 5-Aza-CdR;在 4 个土壤或底泥样品中,有3个被检测出具有可以观察到的去甲基化表观遗传毒性,详见表2。

2.3 环境样品重金属提取液成分检测结果

环境样品重金属提取液成分检测分析发现,共检测到18种元素,在9个测试样中锰、钡、硼、钛、钴的检出率为100%,4个土壤或底泥样品中除了硒和铍未检出外(其中一底泥样品对硒也有检出),其余16中元素均有检出;毒性当量最高的为0.257 μmol·L-1的5-Aza-CdR的安徽宿州涌桥的底泥样品重金属检测发现,这个样品中Cd的浓度为1.62 mg·Kg-1,超过土壤中的标准限值1.00 mg·Kg-1;其中毒性较高毒性当量为0.142 μmol·L-1的5-Aza-CdR的地下水样品,检测发现其中的Mn的浓度为4868.87 μg·L-1,超过土壤中的标准限值300 μg·L-1;在3个被检测出具有可以观察到的去甲基化表观遗传毒性土壤或底泥样品中,检测发现存在不同程度的Cd超标。环境样品表观遗传毒性检测结果也与环境分析结果具有基本一致的趋势,详见表3。

表2 典型环境样品相关信息及重金属提取液的表观遗传毒性评价结果Table 2 Related information on typical environmental samples and evaluation on epigenetic toxicity of extraction of heavy metals

表3 环境样品重金属提取液成分检测结果Table 3 The test result on ingredients of heavy metals extraction in environmental samples

3 讨论(Discussion)

环境保护的终极目标是优化环境质量,规避人群健康风险。到目前为止,我们采取了环境标准的策略来保护环境质量。但是,单项因子的达标能否为我们安全的生活环境提供切实的保障,是当前很难做出明确回答的科学问题。由于污染物的生物富集和放大,低浓度污染的复合效应存在,即使单项因子达标,也不能保障暴露人群免于受到环境污染的健康危害。开展环境介质的毒性效应综合评价是未来环境污染管理不可避免的关键科学问题。到目前为止,已经开展的健康危害评价涵盖急性毒性评价、慢性毒性评价等方面。慢性毒性评价包括致突变、致畸性、致癌等,其与环境污染更为密切,对于环境保护和环境管理的意义更为重要。新近研究发现,在传统关注的“三致”等健康危害之外,以去甲基化能力为代表的表观遗传毒性更应该得到足够重视,因为这种新型的表观遗传毒性在环境中更为广泛,比“三致”毒性更容易出现[15]。事实上,国际上有专家已经开始认为以去甲基化能力为代表的表观遗传毒性成为了环境污染物对人体健康危害的最前沿,是环境与人体交互作用的第一站[16]。

淮河流域地跨河南、安徽、江苏、山东四省,既往污染严重[17],当地局部人群的癌症发病较多[18],当地群众对浅层地下水系安全也非常关注。我们的表观遗传毒性检测结果显示淮河流域局部癌症发病关注地区的环境样品去甲基化能力值得关注,就本研究采集的环境样品而言,大多数环境样品去甲基化能力较强,具有不容忽视的表观遗传毒性。样品提取液成分扫描检测结果显示,一个地下水样品Mn超标,4个土壤或底泥样品不同程度的Cd超标,当地局部地区确实存在一定程度的污染,这与表观遗传毒性检测结果相符,且随着污染物浓度的提高其去甲基化表观遗传毒性有上升的趋势,运用EGFP方法能够快速检测出具有可观察到去甲基化表观遗传毒性的环境样品。那么多种污染物的复合健康效应是否严重,长期生活在这种环境下是否能导致人体关键基因启动子DNA的显著去甲基化都不清楚,而这种毒性对人体健康有多大影响也尚不清楚,有待我们去进一步研究。

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