邻苯二甲酸丁基苄酯致神经细胞氧化损伤

闵安娜，刘锋明，晏彪，陈明清，杨旭

华中师范大学生命科学学院 调控与整合生物学湖北省重点实验室，武汉430079

近年来，饮料、白酒等行业频频发生的塑化剂污染事件引发了人们对食品安全的普遍担忧，并将邻苯二甲酸酯(phthalate esters，PAEs)推向了公众视野。邻苯二甲酸酯又称酞酸酯，是世界上产量最大、应用最广，人工合成的有机化合物之一，也是一类全球性的环境污染物［1］。邻苯二甲酸丁基苄酯(butyl benzyl phthalate，BBP)是邻苯二甲酸酯类化合物(PAEs)的一种，是应用最广泛的邻苯二甲酸酯之一。由于BBP应用广泛、难以降解，因此成为备受关注的全球性环境污染物之一。BBP被美国国家环保局(EPA)列为优先控制污染物［2］。而中国是世界上最大的增塑剂消费国，占全球消费量的1/4，因此，BBP的危害和污染控制更应该引起高度的重视。BBP可以作为增塑剂、软化剂、添加剂和载体来使用，广泛应用于塑料制品、儿童玩具、工业涂料、化妆品、汽车、服装、农药等行业。由于BBP与高分子聚合物之间不是以共价键化学结合，而是物理结合，随着时间的推移，BBP会慢慢从材料中逸出，污染空气、土壤、水源乃至食物。因此，在城市污泥及大气中BBP有较高的含量［3-4］。BBP可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，其中，经饮食进入体内是最主要的途径，已在人的尿液、乳汁、血液和精液等体液中检测出BBP［5-6］。邻苯二甲酸丁基苄酯被认为是一种环境激素干扰物，具有生殖和发育毒性［7］。研究表明，BBP可以改变性别分化、使子宫增大，对胎儿具有一定的致畸性。BBP还可以导致睾丸发育不良，睾酮水平降低［8］。BBP的生殖毒性被研究得最多，BBP对雄性和雌性的生殖都有影响，其中对雄性的影响较大，国内外对BBP的生殖和发育毒性报道较多，但对神经系统的危害还不甚明了。有研究表明，长期接触BBP会在一定程度上损害神经系统，导致神经衰弱和记忆力下降［9-11］。但BBP对神经细胞的毒性效果和影响机理并不清楚。

为此，本研究拟通过体外检测BBP对小鼠神经瘤细胞的毒性和氧化损伤水平来探讨BBP神经毒性效应，并将进一步探讨BBP导致神经毒性的机理。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 主要试剂与仪器

仪器:细胞培养箱，低温冷冻离心机(Eppendorf-5415R)，电热恒温水箱，涡旋器，全波长酶标仪(Bioteck)，荧光酶标仪(Bio-teck)。

试剂:邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)，(Sigma公司，纯度 ＞ 99%)，2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(Sigma公司，纯度＞97%)，硫代巴比妥酸(TBA，国药集团化学试剂有限公司)，5’，5’-二硫代二硝基苯甲酸(DTNB分析纯，国药集团化学试剂有限公司)其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养

本研究所用细胞是未分化的小鼠神经瘤母细胞(N2a)。细胞培养条件为37℃，5%CO2的环境，所用培养基为90%DMEM和10%FBS，每2 d传代一次。

1.3 噻唑比色(MTT)试验

将长势良好(达到106个细胞/ml)的N2a细胞，加入新鲜的培养基中，吹打、悬浮、混匀，铺板于96微孔板中(每孔100 μL)，四周用PBS代替。培养18 h之后，分别用不同浓度的BBP染毒液(0.08、0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1)作为实验组进行染毒，即将BBP与二甲基甲酰胺(DMF)按体积比1:1混合配制成10 g·L-1的染毒母液，按比例稀释成0.08、0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5 g·L-1的染毒液进行试验。同时设置对照组DMEM和DMF，染毒时长为24 h。吸出染毒液，用PBS洗一次，再加入180 μL 培养基，每孔加入 20 μL，5 mg·L-1的 MTT 溶液，黑暗中孵育4 h，37℃。再吸出培养基，加入150 μL DMSO，低速振荡 10 min，测 OD490nm。

1.4 细胞凋亡的检测(Hoechst 33258染色法)

将N2a细胞以5×105mL-1接种于用35 mm培养皿，35 mm 培养皿每孔1.5 ～2 ml，37 ℃，5%CO2孵箱中培养至细胞贴壁。加入BBP染毒液，继续培养过夜。用4%多聚甲醛在4℃固定10～20 min。去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，吸尽液体。摇动洗涤后，加Hoechst 33258染色液，室温10 min，再用PBS洗两遍，每次3 min，超净台中避光风干，在荧光倒置显微镜下观察。

1.5 氧自由基(ROS)水平的测定

细胞中活性氧(ROS)水平的测定使用的是DCF荧光法［12］。将神经瘤细胞铺板于96微孔板中，培养18 h 之后分别用不同的BBP 染毒液(0.16、0.32、0.625、1.25、2.5、5、10 g·L-1)进行染毒，用 DMEM、DMF 作为对照组，NAC作为阻断组，染毒时长为24 h。将染毒细胞用PBS重悬。将10 mmol·L-1的DCFH-DA荧光染料用PBS缓冲液稀释1 000倍，加入100 μL待测细胞重悬液混匀，在37℃下避光保存10 min后，测量其在480 nm激发光，520 nm发射光下的荧光强度。

1.6 丙二醛(MDA)含量的测定

丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸(TBA)法，MDA可与TBA缩合，形成红色产物，且在532 nm处有最大吸收峰，通过吸光值的测量、计算，就可知道细胞中MDA的含量［13］。取10 mL试管，每管加入0.5 mL待测样品液，调零管加入0.5 mL PBS，然后各管加入2 mL 0.6%TBA溶液，混匀后沸水浴15 min，取出后流水冷却。10，000 rpm离心10 min，取上清液分别在450 nm、532 nm和600 nm波长下测定吸光值，按照公式 C/MDA=6.45(D532-D600)-0.56D450，计算出每管样品中 MDA 的浓度［14］(μmol·L-1)。

1.7 还原型谷胱甘肽(GSH)含量的测定

还原型谷胱甘肽(GSH)的含量采用荧光染料DTNB来测定，GSH为易溶于水的巯基化合物，它可以与无色的DTNB结合，形成黄色的5-巯基-2硝基苯甲酸，该物质在412 nm处有最大光吸收，通过光吸收值的测定、计算，即可得出细胞中 GSH的量［15］。取 200 μL 细胞悬液，加入 50 μL 浓度为10%的TCA，混匀。10，000 rpm，离心5 min。然后取 50 μL 上清加入酶标板，再加 150 μL，60 ng·mL-1的DTNB室温避光5 min，测定412 nm波长下的吸光值。

1.8 统计学分析

用Origin 6.1统计分析软件对实验数据先进行ANOVA分析，然后用t检验法检验染毒组与对照组之间的差异。

2 结果(Results)

2.1 MTT 实验结果

为检测BBP的细胞毒性，我们进行了MTT实验(图1)。实验结果显示对照组DMEM和DMF组之间无显著性差异，说明DMF可以作为一种对细胞伤害较小的良好的促溶剂。随着染毒浓度的增加，细胞存活数目减少，在BBP暴露剂量为10 g·L-1时出现了显著性差异。随着染毒浓度的升高，细胞呈现出膨大，裂解，不规则状态。但是有趣的是在较低浓度组时，细胞的MTT值较对照组有比较明显的升高，这提示低浓度的BBP可能对细胞的生长有促进作用。

图1 不同浓度BBP染毒对N2a细胞的存活的影响(与空白组相比，*p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Fig.1 The effect of BBP on the relative survival rate of N2a cells(compared with control group，*p＜0.05,**p＜0.01)

2.2 细胞凋亡的染色检验

通过不同浓度的BBP染毒后，对N2a细胞进行了Hoechst 33258染色分析(图2)。Hoechst 33258染色结果显示:随着染毒浓度的增加，细胞存活减少，并且细胞核不规则程度增加，开始出现凋亡小体;并且在常规镜下观察时，发现细胞界限不清，培养基中漂浮的细胞增多，并且细胞粘附能力即贴壁能力下降，容易被吹打下来。

2.3 ROS测量结果

通过DCF荧光法我们检测N2a细胞中的ROS水平。结果显示对照组DMEM与DMF组并无明显差别，随着染毒浓度的增加，ROS荧光越来越强(图3)，这表明BBP导致了ROS水平的升高。研究发现:随着染毒浓度的增加，细胞形态由椭长形变圆形或椭圆形，细胞贴壁能力下降，细胞之间的交联度下降。在最高浓度组出现了凋亡小体。

图2 Hoechst 33258染色结果(A:DMEM组;B:DMF组;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)Fig.2 The results of Hoechst 33258 by different concentrations of BBP(A:DMEM group;B:DMF group;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)

图3 不同BBP染毒浓度下的ROS荧光图 (A:DMEM组;B:DMF组;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)Fig.3 The results of ROS fluorography by different concentrations of BBP(A:DMEM group;B:DMF group;C:0.08 g·L-1;D:0.16 g·L-1;E:0.32 g·L-1;F:0.625 g·L-1;G:1.25 g·L-1;H:2.5 g·L-1;I:5 g·L-1;J:10 g·L-1)

进一步分析实验数据发现:DMEM和DMF组之间并无显著性的差异，说明DMF是一种良好的促溶剂，对细胞的影响较小。NAC作为阻断剂，ROS出现降低现象，另外染毒组随着染毒浓度的增加ROS出现上升趋势，而且在 0.16 g·L-1和 0.31 g·L-1出现显著性差异(p ＜0.05)，在 0.625 g·L-1、1.25 g·L-1、2.5 g·L-1和 10 g·L-1时出现极显著性差异(p ＜ 0.01)说明BBP暴露导致了神经瘤细胞出现氧化应激效应。

2.4 MDA 实验结果

为检测BBP对N2a细胞的氧化损伤，我们测定了细胞的MDA含量(图5)。结果显示:随着BBP染毒浓度的增加，MDA系数呈现上升的趋势。当BBP的浓度为10 g·L-1时与对照组相比出现了显著性差异。说明BBP能够对小鼠神经瘤细胞产生脂质过氧化，并且随着BBP浓度的越大，氧化损伤程度越高。

2.5 GSH实验结果

通过GSH实验我们发现:随着染毒浓度的增加，GSH系数呈现下降趋势(图6)，且在0.32 g·L-1时出现显著性差异，在 0.625、1.25、5 和 10 g·L-1时出现极显著性差异。以上结果表明BBP能够使小鼠神经瘤细胞产生氧自由基，并且BBP浓度的越大，氧化损伤程度越高，消耗的GSH的量也更多。

图4 不同浓度BBP染毒(g·L-1)对N2a细胞ROS含量的影响(与空白对照组相比，*p ＜0.05，＊＊p ＜0.01)Fig.4 The effect of different exposure groups on ROS content in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

图5 不同浓度BBP染毒(g·L-1)对N2a细胞的MDA系数的影响(与对照组相比，*p＜0.05，＊＊ p ＜0.01)Fig.5 The effect of different exposure groups on MDA ratio in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

图6 不同浓度BBP染毒(g·L-1)对GSH系数的影响(与对照组相比，*p＜0.05，＊＊ p＜0.01)Fig.6 The effect of different BBP exposure groups on G SH ratio in N2a(*p＜0.05,**p＜0.01,compared with control group)

3 讨论(Discussion)

邻苯二甲酸丁基苄酯是最广泛使用的酞酸酯之一。由于邻苯二甲酸丁基苄酯的大量生产和在生活中的大量使用，邻苯二甲酸丁基苄酯对人和动物的暴露，事实上是难以避免的。在作为增塑剂使用时，由于BBP不与高分子材料共价结合，因而极易外泄进入环境。可通过饮食、呼吸、皮肤接触等途径进入人和动物体内。因此，世界上很多国家把BBP列为优先控制的污染物。

评价邻苯二甲酸酯的毒性及其致病机制是当前的研究热点之一。特别是邻苯二甲酸酯被认为是一种内分泌干扰物，它的生殖毒性和发育毒性引起了人们广泛的重视，并得到了很多动物毒理学及流行病学调查研究的支持［16-17］。截至目前，对BBP的毒性研究仍然主要停留在它的生殖毒性、氧化损伤作用上［18-20］，而且也已经有了比较完备的反应机制来解释氧化损伤的原因。并且提出了邻苯二甲酸酯相关毒性的分子模型来更加完整的解释PAEs对人或动物的毒性。然而BBP对神经系统毒性却鲜有文献报道。我们通过MTT实验和Hoechst 33258染色分析对BBP的细胞毒性进行了评价。结果表明当BBP染毒浓度到5 g·L-1以上时，存活细胞减少，并且细胞界限不清，开始出现凋亡小体。这表明高浓度的BBP可以抑制神经细胞的生长，导致神经细胞的凋亡。

氧化损伤被认为是引起机体细胞衰老、损伤、凋亡、死亡的重要原因。已有研究认为DEHP、DBP、BBP等邻苯二甲酸酯类都能导致氧化损伤［21-22］。Wormutd等对离体大鼠肺细胞进行BBP染毒，结果表明BBP对大鼠肺细胞有着明显的毒性作用，能使其发生氧化损伤［23］。为探讨BBP暴露对神经细胞的毒性作用机制，我们以神经瘤细胞为模型细胞进行研究。我们检测了小鼠神经瘤细胞的氧化损伤水平。研究结果显示BBP导致神经瘤细胞中活性氧自由基含量水平显著上升，特别是在0.625 g·L-1的BBP染毒组与对照组相比具有极显著性差异(p＜0.01)。MDA检测表明BBP能够对神经瘤细胞产生脂质过氧化，并且随着BBP浓度的增大，氧化损伤程度升高。GSH检测显示BBP染毒随着染毒剂量的升高，细胞中GSH含量逐渐下降。染色观察也发现细胞出现凋亡现象，因此，我们认为BBP可以引起神经瘤细胞的氧化损伤。在高浓度的BBP作用下，神经瘤细胞发生了氧化损伤，这种损伤又导致了神经细胞的凋亡。

但是，BBP的其他相关毒性的作用还不确定，比如BBP是通过改变组织基因水平的表达还是改变激素的代谢水平来干扰内分泌系统?虽然已经有学者研究发现，在细胞受到氧化损伤后细胞会启动相应的调亡程序，细胞内相关的信号通路的某些关键蛋白的表达和调控会发生明显的改变［24］;但是这一机制是否可以用来解释BBP对细胞的毒性作用，进而导致了它的神经毒性，还值得进一步探讨。

［1］Wezel A P，Vlaardingen V，Posthumus R，et al.Environmental risk limits for two phthalates，with special emphasis on endocrine disruptive properties［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2000，46(3):305－321

［2］张锡辉.高等环境化学与微生物学原理及应用口咽［M］.北京:化学工业出版社，2001:147－149

［3］Cantreeds W.Comparision between the organic fraction of suspended matter at a background and an urban station［J］.Science of the Total Environment，1997，8(1):79 －88

［4］莫测辉，蔡全英，吴启堂，等.我国城市污泥中邻苯二甲酸酯的研究［J］.中国环境科学，2001，21(4):362－366

［5］MikμLa P，Svobodová Z，Smutná M.Phthalates:Toxicology and food safety-a review［J］.Czech Journal of Food，2005，23(6):217－223

［6］刘慧杰，舒为群.邻苯二甲酸酯类化合物的毒理学效应及对人类健康的危害［J］.第三军医大学学报，2004，26(19):1778－1781

［7］Swan S H.Environmental phthalate exposure in relation to reproductive outcomes and other health endpoints in humans［J］.Environmental Research，2008，108(2):177－184

［8］Lyche J L，Gutleb A C，Bergman A，et al.Reproductive and developmental toxicity of phthalates［J］.Journal of Toxicology and Environmental Health，Part B:Critical Reviews，2009，12(4):225－249

［9］Minoru K.Toxicity of butylbenzyl phthalate(BBP)and other phthalate esters to nervous tissue in cμLture［J］.Toxicology Letters，1980，6(6):373－378

［10］杨波，李文兰.邻苯二甲酸丁基苄酯对雄性大鼠生殖系统影响［J］.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2006，(5):11－13

［11］Tanida T，Warita K，Ishihara K，et al.Fetal and neonatal exposure to three typical environmental chemicals with different mechanisms of action:Mixed exposure to phenol，phthalate，and dioxin cancels the effects of sole exposure on mouse midbrain dopaminergic nuclei［J］.Toxicology Letters，2009，189(1):40－47

［12］聂金雷，时庆德，张勇，等.利用荧光探针直接测定线粒体活性氧的形成［J］.中国应用生理学杂志，2002，18(2):196－198

［13］Tandon V，Gupta R K.Effect of Vitex negundo on oxidative stress［J］.Indian Journal of Pharmacology，2005，37(1):38－40

［14］张志良.植物生理学实验指导(第二版)［M］.北京:北京高等教育出版社，1990

［15］马萍，杜娟，罗清，等.纳米Fe3O4对小鼠肺细胞的氧化损伤［J］.生态毒理学报，2012，7(1):44－48

［16］Ma P，Du J，Luo Q，et al.Fe3O4nanoparticles to the oxidative damage of rats＇pneumonocyte［J］.Asian Journal of Ecotoxicology，2012，7(1):44－48(in Chinese)

［17］Seo K W，Kim K B，Kim Y J，et al.Comparison of oxidative stress and changes of xenobiotic metabolizing enzymes induced by phthalates in rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2004，42(1):107－114

［18］McIntyre B S，Barlow N J，Wallace D G，et al.Effects of in utero exposure to linuron on androgen-dependent reproductive development in the male Crl:CD(SD)BR rat［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2000，167(2):87－99

［19］Schanbacher B D，Ewing L L.Simultaneous determination of testosterone，α-androstan-17β -ol-3-one，5α-androstane-3alpha，17β-diol and 5α-androstane-3β，17βdiol in plasma of adult male rabbits by radioimmunoassay［J］.Endocrinology，1975，97(4):787 －792

［20］Parks LG，Ostby J S，Lambright C R，et al.The plasticizer diethylhexyl phthalate induces malformations by decreasing fetal testosterone synthesis during sexual differentiation in the male rat［J］.Toxicological Sciences，2000，58(2):339－349

［21］McIntyre B S，Barlow N J，Sar M，et al.Effects of in utero linuron exposure on rat Wolffian an duct development［J］.Reproductive Toxicology，2002，16(2):131－139

［22］Gray L E，Ostby J，Furr J，et al.Perinatal exposure to the phthalates DEHP，BBP，and DINP，but not DEP，DMP，or DOTP，alters sexual differentiation of the male rat［J］.Toxicological Sciences，2000，58(2):350－365

［23］Wormuth M，Scheringer M，Vollenweider M，et al.What are the sources of exposure to eight frequently used phthalic acid esters in Europeans［J］.Risk Analysis，2008，6(2):803－824

［24］王婧，蔡凤云，曾强，等.邻苯二甲酸丁基苄酯致大鼠肺细胞氧化损伤作用的体外研究［J］.医学研究杂志，16－18

［25］李文兰，季宇彬，姜安玺，等.环境激素邻苯二甲酸丁基苄酯在动物脏器中的代谢［J］.哈尔滨工业大学学报，2005(12):1674－1677