纳米水稳型C60(nC60)促进Zn2+和Cr6+ 在大型溞体内的吸收、抗氧化性和急性毒性

余言想， 魏 华， 陶贤继, #， 何义亮，吕为群

1. 上海海洋大学 水产与生命学院 上海海洋大学水产动物遗传与育种中心， 上海 201306 2. 上海农林职业技术学院，上海 201699 3. 上海交通大学 环境科学与工程学院， 上海 200240

富勒烯(C60)是一种具有独特物理化学性质的纳米材料，被广泛应用于药物传递、有机磁体和能量转化等方面[1-3]。随着富勒烯的大量生产和使用，人们越来越关注富勒烯散失到环境中可能造成的生态毒性作用。C60纳米颗粒通过各种途径进入水体，然后在水体中形成纳米水稳型C60(nC60)，对水生生物产生毒性，进而影响整个水生生态系统。

有关nC60对水生生物和水生生态系统造成毒性损伤的研究很多。例如，nC60对斜生栅藻的生长有抑制作用，96 h-EC50为13.1 mg·L-1，且呈现明显的剂量-效应相关关系[4]。nC60对大型溞等水生无脊椎动物产生急、慢性毒性及生殖毒性，对大型溞48 h-LC50为0.43 mg·L-1[5]。富勒烯诱导大口黑鲈脑部脂肪超氧化作用[6]、阻碍斑马鱼胚胎的发育，增强斑马鱼体内的抗氧化性酶的活性(CAT、GSH-PX)，并抑制鱼类生长[7]。以上研究主要集中于C60单独对水生生物产生危害，但低剂量(低于0.1 mg·L-1)nC60与重金属交互作用对水生生物产生风险的报道却很少。

nC60因具有特殊的物理化学性质，可以促进环境中其他有毒物质的转移[8]。有报道证明nC60对其他污染物有很强的吸附能力，因此可能改变他们运输中的动力学过程[9,10]。这些发现也使科学家越来越关注nC60如何影响其他污染物的毒性。有关富勒烯C60单独的生物学影响的报道很多，但是水生生态系统中富勒烯与其他污染物混合后产生的毒性效应的研究报道却很少。

为了更好的了解nC60与其他污染物在水生生态系统中潜在的相互作用，本试验研究了nC60存在下Zn2+和Cr6+对大型溞的毒性作用。选取大型溞为受试物主要是因为大型溞在水生食物链中扮演着不可或缺的角色，其本身对外界环境中的污染物很敏感[11-13]。同时本试验是对纳米颗粒在环境中的归宿、运输和转化研究的补充。尽管越来越多的科学家开始研究纳米颗粒的联合毒性作用，但目前大家对该领域了解甚少[14,15]。

锌(Zn)与铬(Cr)是两种常见的重金属元素。Zn作为一种痕量必需金属元素，是体内重要酶的辅基[16]。但过量的Zn2+积累在生物体内会对生物造成毒性损伤。例如，高浓度的Zn2+抑制黄姑鱼胚胎发育，降低受精卵的孵化率[17]；过量的Zn2+也会影响黑褐新糠虾(Neomysisawatschensis)的生长、成活、繁殖[18]。Cr是一种生物体必需的微量元素，是生物体正常生长发育和调节血糖的重要元素。但过量的Cr6+降低了斑马鱼体内CAT活性[19]，它诱导L-02肝细胞凋亡和氧化损伤[20]。C60进入水体后形成nC60颗粒[21]，目前已知易于与微量元素Cu2+发生联合作用[22]。是否会与重金属离子Zn2+和Cr6+发生联合作用，目前尚不清楚。本文以大型溞为研究对象，研究nC60与两种重金属离子(Zn2+和Cr6+)联合毒性效应，为nC60与其他重金属离子之间的联合作用提供一定参考。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 受试生物：大型溞于2009年购自Carolina Biological Supply Company。按照美国EPA标准方法培养。具体方法如下：将大型溞培养在含有2 000 mL的中等硬度水的三角锥瓶中，培养温度为21±1℃，光周期12 h：12 h，溶解氧为6.5 mg·L-1以上，光照强度为3 000 Lx左右。每天定时添加斜生栅藻，藻类具体培养方法见文献[23]。

1.2 化学试剂

试剂：C60(≥99.9%)为升华法提纯品，购自美国Materials Electronics Research Corporation。四氢呋喃和甲苯都是液相色谱纯，购于Fisher Scientific公司。Zn2+和Cr6+的标液(介质为硝酸，浓度为1 g·L-1)，购于上海阿拉丁试剂公司，实验开始前将原液(1 g·L-1)稀释至1 mg·L-1备用。SOD酶测定试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。其他相关试剂均为分析纯或者优级纯，购于上海国药集团。

1.3 试验方法

1.3.1 nC60的制备

按照Fortner等[24]的方法制备nC60，具体步骤：称量100 mg C60，溶解于4 L THF中，冲入氮气去除上部氧气，并用封口胶带密封保存，在磁力搅拌器上搅拌24 h(避开强光)备用。以500 mL·min-1的速度，将250 mL纯水迅速通过漏斗加入到250 mL C60饱和四氢呋喃(THF)溶液中并且不断搅拌形成nC60，使用旋转蒸发仪(Büchi Rotovap system)连续蒸馏3次用以去除里面的THF和THF衍生物。冷却过夜形成稳定平衡的溶液，用0.22 μm的醋酸纤维膜过滤后备用。为了进一步去除THF和THF的衍生物，nC60溶液使用旋转过滤杯 (YM 10 000 MW超滤膜)，连续更换10次溶剂(超纯水)中的一半，加压洗涤去除nC60水溶液中剩余溶剂里面99.5%以上的THF，使用GC-MS未检测到THF及其衍生物的存在。用于试验的nC60悬浮液的平均尺寸是98.0 nm(使用dynamic light scattering (DLS)测定)[5]。

1.3.2 nC60的无效应最高浓度(NOEC)的确定

nC60对大型溞急性毒性试验参照EPA 2024方法进行，以确定最高NOEC。配制0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mg·L-1的nC60浓度组，每个浓度组设置3个平行，每个试验平行组放置10只幼溞。每6 h观察一次死亡情况，连续试验48 h。计算48 h后nC60对大型溞的致死率。利用EPA Probit法[17]计算48 h半致死剂量浓度(LC50)和分析最大无观察效应浓度(NOEC)。最大NOEC数值用于接下来联合毒性试验。

1.3.3 nC60对重金属急性毒性的影响

使用EPA 2024标准对大型溞进行48 h急性毒性试验，检测nC60与重金属联合毒性作用。根据预实验，Zn2+最终浓度分别为0、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mg·L-1；Cr6+最终浓度分别为0、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45和0.48 mg·L-1，所有实验组设置3个平行。所有浓度组的最终体积为100 mL。 每组放10只24 h内出生的幼体大型溞。实验过程中，每隔6 h记录一次大型溞的存活数，试验时间为48 h。利用EPA Probit法分析实验数据，计算Zn2+和Cr6+的48 h-LC50。

1.3.4 nC60对Zn2+、Cr6+在大型溞体内积累的影响

根据急性毒性实验结果，使用中等硬度水分别配置nC60浓度为0.10 mg·L-1，Zn2+浓度为0.50 mg·L-1和Cr6+浓度为0.30 mg·L-1的试验溶液，最终体积为1 000 mL。以中等硬度水作为对照。每瓶放入50只5日龄(未怀卵)的大型溞。分别在第0、10、20、30、60、120、180、720和1 440 min随机取4只大型溞，用中等硬度水清洗大型溞3次(洗去吸附体表的重金属)。吸干体外粘附的水分，用0.20 mL浓硝酸消解至肉眼不可见颗粒物，最后用去离子水定容至20 mL。Zn2+浓度由原子吸收光谱仪(GBC 932 plus)测定(测定波长为283.3 nm)。Cr6+浓度成分用原子吸收分光光度计(TAS 990，普析通用)测定(测定波长为357.9 nm)。

1.3.5 nC60促进重金属对大型溞体内SOD酶活力的影响

酶活性试验暴露浓度的设置与积累实验相同，最终浓度为nC60为0.10 mg·L-1，Zn2+浓度为0.50 mg·L-1，Cr6+为0.30 mg·L-1。每瓶放入50只5日龄大型溞，分别在第0、10、20、30、60、120、180、720和1440 min连续随机取样4只，先用去离子水清洗几分钟，然后加入1 mL Tris-蔗糖缓冲液，冰浴条件下用玻璃匀浆器快速匀浆，匀浆后转入1.5 mL离心管中，于12 000 rpm下离心10 min，获得的上清液(粗酶液)用于酶活性测定。蛋白含量、SOD酶活力采用南京建成生物研究所试剂盒测定。蛋白质浓度根据吸光值标准曲线计算(y= 105.32x-3.99，(R2= 0.99))。

1.4 数据统计与分析

利用EPA Probit法分别计算LC50。数据采用Office Excel 2007和SPSS 17.0软件进行作图与分析，显著性差异检验采用ANOVA方差分析，p< 0.05表示统计有显著性差异

2 结果(Results)

2.1 nC60的最高无效应浓度(NOEC)的确定

大型溞幼体死亡率随nC60浓度的增加而增大(图1)。48 h后，0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50和0.60 mg·L-1各浓度组大型溞的死亡率分别为0、0、10、20、40、50和70%。利用EPA Probit法计算nC60的48 h-LC50为0.47 mg·L-1，观察出NOEC为0.10 mg·L-1。该结果与Tao等[5]的结果(LC50为0.43 mg·L-1)接近。据此，0.10 mg·L-1将作为本文后续所采用亚急性联合毒性试验中nC60的浓度。

2.2 nC60与Zn2+和Cr6+对大型溞的联合毒性

大型溞的死亡率随着Zn2+、Cr6+浓度的增加、暴露时间的延长不断增大； nC60会增强Zn2+、Cr6+对大型溞的急性毒性(图2、3)。Zn2+对大型溞的48 h-LC50为2.33 mg·L-1，95%置信限范围为2.20～2.46 mg·L-1；而在有nC60存在下，Zn2+对大型溞的48 h-LC50为1.52 mg·L-1，置信区间为1.45～1.60 mg·L-1；无nC60时，Cr6+对大型溞的48 h-LC50为0.40 mg·L-1，95%置信限范围为0.39～0.41 mg·L-1；有nC60时，Cr6+对大型溞的48 h-LC50为0.33 mg·L-1，置信区间为0.32～0.33 mg·L-1。由此可见nC60增强了Zn2+、Cr6+对大型溞的急性毒性作用(p< 0.05)。在0.10 mg·L-1nC60浓度下，大型溞在1.50、2.00、2.50、3.00和3.50 mg·L-1Zn2+的暴露下，24 h死亡率分别增加100%、50%、100%、100%、75%。在0.10 mg·L-1nC60浓度下，大型溞在0、0.33、0.36、0.39、0.42、0.45、0.48 mg·L-1的Cr6+暴露下，24 h死亡率分别增加100%、50%、100%、100%、75%。除此之外，有nC60存在时，相同浓度的Zn2+、Cr6+大型溞出现死亡的时间较无nC60要短，而且大型溞出现死亡的时间随着重金属浓度的增加而缩短。

图1 nC60对大型溞幼体死亡的影响Fig. 1 Concentration-dependent mortality of D. magna to nC60

图2 nC60与Zn2+对大型溞的联合毒性Fig. 2 The joint toxicity of nC60 and Zn2+ on D. magna

2.3 nC60促进Zn2+和Cr6+在大型溞体内的蓄积

不论有无nC60存在条件下，大型溞体内Zn2+、Cr6+的浓度都随着暴露时间延长而增大(图4)。当有nC60(浓度为0.10 mg·L-1)存在时，大型溞体内的Zn2+、Cr6+的蓄积比无nC60时显著增加(p< 0.05)。无nC60存在时，1 440 min Zn2+浓度达到最大值6.52 μg·g-1湿重；有nC60存在时，1 440 min Zn2+浓度达到最大值9.98 μg·g-1湿重。1 440 min后，在nC60促进下，大型溞对Zn2+蓄积量增加53.06 %。nC60不存在时，1 440 min大型溞体内 Cr6+蓄积浓度达到最大值1.52 μg·g-1湿重；nC60存在时，1 440 min 大型溞体内Cr6+蓄积浓度达到最大值3.01 μg·g-1湿重。nC60促进了大型溞对Cr6+累积量增加98.02%。

生物富集系数计算见方程(1):

(1)

图3 nC60与Cr6+联合对大型溞毒性Fig. 3 The joint toxicity of nC60 and Cr6+ on D. magna

图4 nC60促进Zn2+ ,Cr6+大型溞体内的积累. Fig. 4 nC60 enhanced the accumulation of Zn2+, Cr6+ in D.magna.

1 440 min后，有nC60存在时，Zn2+的生物累积系数为19.96，而无nC60存在时生物累积系数为13.04。有nC60存在时，1 440 min后Cr6+的生物累积系数为10，而无nC60时，1 440 min后Cr6+的生物累积系数为5.06。两种重金属的生物富集系数在有nC60存在时增大，结果表明，nC60存在使得Zn2+和Cr6+的蓄累量增加。无nC60时，大型溞对Zn2+的吸收速度大于对Cr6+的吸收速度，相同时间大型溞吸收Zn2+的量也大于Cr6+。nC60使得Zn2+和Cr6+在大型溞体内蓄累量都有一定的增加，但相比Zn2+，nC60更能促进在大型溞体内的蓄积。

2.4 nC60与Zn2+和Cr6+对大型溞体内SOD酶的联合作用

对照组大型溞体内SOD酶活性不随着试验时间的延长发生明显的变化，而试验各组SOD酶活性随着暴露时间的延长增大(图5)。其中，nC60和Zn2+同时存在时的SOD酶活性高于只有nC60存在或只有Zn2+存在时SOD酶活性(p< 0.05)，24 h SOD酶活性较对照组分别增加了18.75%、35.37% 和54.68%。nC60和Cr6+同时存在时，SOD酶活性高于只有nC60存在或只有Cr6+存在时SOD酶活性(p< 0.05)，24 h SOD酶活性分别比对照组增加了30.62%、43.63%和65.37%。由此可见，nC60和Zn2+、Cr6+同时存在时，体内的产生的氧自由基最多，增强了大型溞体内SOD酶的活性。除此之外，Cr6+对SOD酶活性的影响要强于Zn2+对SOD酶活性的影响，这种影响效果与有无nC60是一致的。

3 讨论(Discussion)

3.1 nC60与Zn2+、Cr6+对大型溞的联合毒性

本试验研究结果表明，nC60在NOEC浓度下(0.10 mg·L-1)增加了Zn2+和Cr6+对大型溞的毒性。有关高浓度C60急性毒性的报道很多[5-7]，本试验主要是研究NOEC浓度(对大型溞无明显的致死效应)nC60与Zn2+、Cr6+对大型溞的毒性影响，旨在说明NOEC浓度nC60对重金属毒性强弱的影响。先前的联合作用研究也显示C60纳米颗粒增强其他有毒物质的毒性。例如，Carmen等[26]研究了As与C60对斑马鱼肝脏的联合作用，研究表明肝细胞在暴露于C60(1 mg·L-1)和As3+下，细胞内已有的谷胱甘肽减少、脂质过氧化增强，并且这种作用要强于只有As3+存在的条件。不同生物对C60敏感度不同，本试验针对大型溞选取和Carmen不同的C60浓度进行研究，但在有毒物质毒性增强方面结果一致。Baun等研究发现nC60可以增加菲对藻、大型溞的毒性，其毒性分别增加了60%和1 000%[27]。对大型溞的毒性增加效果要强于本试验中Zn2+、Cr6+对大型溞的毒性，这可能与nC60的浓度和与nC60的作用方式不同有关。以上都是关于C60加强其他有害物质毒性方面的研究，但也有相关报道[28-30]显示胶体可以降低重金属的毒性，可能是这些胶体和重金属的作用机制和nC60不同，nC60本身带负电，容易和带正电的重金属结合，导致重金属在生物体内蓄积过量。所以，在有重金属的环境中，特别是必需痕量重金属的环境中，评价纳米颗粒的毒性时，C60的载体功能是一个应该考虑的重要因素。

图5 nC60与Zn2+ ,Cr6+对大型溞体内SOD酶活力的影响Fig. 5 nC60 and Zn2+, Cr6+ affect SOD in D. magna.

3.2 nC60促进Zn2+、Cr6+在大型溞体内的积累

重金属积累试验结果表明，nC60促进两种重金属在大型溞体内的积累。C60是疏水性的化合物，能够积累在生物体内[31]。C60本身带负电很容易和带正电的Cu2+结合，结合后共同积累在大型溞体内[22]。早期研究结果证明nC60对疏水性有机污染物有很强的吸附性能[32]，显著增强多氯联苯和菲的迁移能力，重金属和有机物与nC60的作用方式不同，但最终的效果都是增加了这些物质的积累；nC60增加As3+在斑马鱼细胞中的积累[26]，造成斑马鱼的氧化损伤；nC60增加Cu2+在大型溞体内的积累，增加Cu2+对大型溞毒性[22]。本试验结果和以上研究相同，当nC60吸附Zn2+和Cr6+之后，其在溶液中的稳定性减低并聚合形成比原来大的颗粒，从而被大型溞摄取，积累在体内。这种积累增大重金属的毒性，产生毒性增强的效果。生物累积假说指出，生物累积不仅受化学物质本身性质和生物种类的影响，而且受到水体外界环境的影响。例如，水体硬度、温度、pH等。本试验选取的水体环境是大型溞适宜生活环境，并未对外界因素对nC60增加Zn2+和Cr6+在大型溞体内的积累做出研究，以后的工作中将加强对该方面的研究。除此之外，本文对于nC60通过何种途径增加有毒物质在生物体内积累未做出解释，食物链的传递可能导致nC60伴随着有毒物质的积累，但这方面的研究尚不足，需要更进一步的研究。

3.3 nC60与Zn2+、Cr6+对大型溞体内SOD酶活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)是一种普遍存在于动植物体内的金属酶，可以清除体内氧自由基，保护机体免受活性氧自由基(ROS)的损伤[33]。对照组SOD酶活性没有发生明显的变化，各试验组酶活性增大，并且只存在nC60或只存在重金属离子时对酶活性的诱导程度要远小于两者同时存在的情况。这与沈杰[34]研究富勒烯衍生物对PC细胞氧化性损伤的结果相同，富勒烯诱导细胞产生氧自由基，激发机体防御系统产生SOD酶，解除ROS对细胞产生的氧化损伤。但这与相关报道[35]研究的富勒烯及其衍生物抑制酶活性的结果不同，结果显示SOD酶活性受到抑制，对细胞造成氧化损伤。这可能是所选取的nC60浓度不同和nC60制备方法不同所造成。本试验nC60、Zn2+和Cr6+所采用浓度都是NOEC浓度，属于低浓度组，因此对酶的活性有诱导作用。两种物质相互作用时，这种诱导作用的强度增大，强于单一物质对SOD酶的诱导作用，出现这种结果可能是两种物质对SOD酶活性影响的加和作用，也可能是两者的协同作用，需要进一步用试验加以验证。本实验是NOEC浓度下对大型溞体内SOD酶活性的影响，没有对其他浓度的重金属影响SOD酶活性做出评价；因缺乏分子生物学基础，未能从分子方面影响机制做出研究，这些需要在以后的试验中加以研究，得到更全面的结论。

基于本试验的研究结果我们认为重金属的毒性评价不能只关注自身的毒性，还需考虑到环境中其他物质与之发生的相互作用。我们发现nC60加强了Zn2+和Cr6+对大型溞的毒性，同时nC60提高了大型溞对Zn2+和Cr6+的累积，大型溞在nC60与Zn2+和Cr6+作用后，SOD酶活性均得到增强。NOEC浓度下nC60与Zn2+和Cr6+作用后，对大型溞毒性作用存在一定的增强效果。

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