印度梨形孢定殖油菜对萝卜蚜选择油菜寄主的影响

刘金华 王婷 高其康

（浙江大学昆虫科学研究所，杭州 310058）

印度梨形孢定殖油菜对萝卜蚜选择油菜寄主的影响

刘金华 王婷 高其康

（浙江大学昆虫科学研究所，杭州 310058）

旨在研究印度梨形孢（Piriformospora indica）定殖油菜（Brassica napus L.）对萝卜蚜（Lipaphis erysimi（Kaltenbach））选择寄主油菜的影响，分别在大棚拟自然环境和实验室人工环境下进行蚜虫双向选择试验，发现萝卜蚜在有印度梨形孢定殖油菜上的数量显著低于无印度梨形孢定殖的油菜。利用顶空动态吸附装置收集不同处理油菜的挥发性物质，通过气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）分析收集到的两者挥发物在种类和含量上的差异。结果表明，有印度梨形孢定殖的油菜与无印度梨形孢定殖的油菜，挥发物的种类没有变化，而挥发物的总量、α-pinene、terpinolene、camphor、β-thujene、cedrene 以及 β-caryophyllene，在单位时间内有印度梨形孢定殖的油菜释放的量显著高于无印度梨形孢定殖的油菜。通过四扇区嗅觉仪测定萝卜蚜对挥发物的生物反应，发现 α-pinene 对萝卜蚜有显著的吸引作用，而 camphor 以及 camphor与α-pinene 浓度比为2∶1混合物对萝卜蚜具有显著的驱避作用，其余物质则没有作用。

印度梨形孢 萝卜蚜 寄主选择 挥发物

油菜Brassica napus L.属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica）植物，是世界上重要的油料作物之一，在我国油菜的历年种植面积占全国油料作物总种植面积的40%以上，产量则占全国油料作物的35%以上。油菜蚜虫是为害油菜最严重的害虫，在我国主要为桃蚜（Myzus persicae）、萝卜蚜（Lipaphis erysimi）、甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae L.）3种，能够通过取食汁液和传播病毒严重影响油菜的产量。

内生真菌是指那些生活史的全部或部分生活于健康植物组织内，但不会对植物产生明显病害症状的微生物［1］，存在于大部分高等植物中［2］，能够调节植物与草食动物的互作［3，4］。内生真菌作为植物

共生物，在获取寄主植物养分的同时能够加强植物对草食动物以及病原物的抗性［5，6］。已有的机理是植物感染内生真菌后能够产生多种生物碱，如吲哚双萜类（lolines）、麦角碱（ergot）、波胺（peramine）等，这些生物碱在植物中的积累能够对不同害虫产生不同程度的毒害作用［7，8］；内生真菌的定殖还能通过改变植物的营养物质（如植物甾醇、固醇）的含量来提高植物的抗病虫害能力［9］。有关内生真菌定殖植物改变植物挥发物的种类和含量，从而影响植物抗虫性的报道很少［10，11］。

植食性昆虫选择寄主植物的行为是一个连锁过程，在寻找寄主时，昆虫通过嗅觉感受器感受寄主植物挥发性次生代谢物从而找到植物。植食性昆虫如何识别植物气味是一个复杂的问题，因为植物释放的挥发物成分种类繁多，且各组分以一定浓度比例协同对昆虫起作用。例如，马铃薯叶片气味中分离鉴定的5种挥发物，以一定比例混合能够对马铃薯甲虫产生引诱作用，而单一成分没有引诱效果［12，13］。植物气味中各成分浓度比例对于植食性昆虫识别寄主植物具有重要影响，昆虫通过识别植物气味的化学指纹图（chemical fingerprint）来识别寄主植物气味，该指纹图是由不同浓度的不同化合物组成的混合物［14-17］。蚜虫［18，19］、茶尺蠖（Ectropis oblique）［11］等植食性昆虫对寄主植物气味的识别反应可以被非寄主植物气味的加入所打破，因为非寄主植物气味成分破坏了原来的指纹图，使得昆虫无法识别。有研究表明，植物挥发物中的某些萜类（terpenoids）物质能够对昆虫产生忌避效果，如单萜类物质linalool，半倍萜类物质（E）-β-farnesene 等能够帮助植物抵御植食性昆虫和蚜虫［20，21］。植物挥发性物质对昆虫定位与取食的影响是一个复杂的问题，既有可能是单种组分对其产生作用，也有可能是多种组分以一定比例共同作用。研究表明，大部分植物在被昆虫取食时，能够释放一系列的挥发性代谢物［22-24］。这些由昆虫取食诱导产生的植物挥发性物质也能够帮助寄生蜂找到寄主昆虫［25，26］。类似的，植物病原菌也能够诱导植物产生特异性挥发性物质，有利或不利于昆虫对寄主植物的区别与定位［26，27］。因此，内生真菌定殖寄主植物是否也会影响植物释放挥发物的种类和含量，从而利于或不利于昆虫定位和寻找寄主植物呢？Jallow 等［10］发现内生真菌Acremonium strictum 感染番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）后，有利于棉铃虫（Helicoverpa armigera）雌虫定位寄主植物。

印度梨形孢（Piriformospora indica）是一种植物根部内生真菌，作为近几年内生真菌研究的热门对象，有其凸显的优势，它能够定殖包括苔藓植物（Bryophytes）、蕨类植物（Pteridophytes）、裸子植物（Gymnosperms）以及大量单子叶和双子叶植物，而且能够在很多合成培养基上生长。另外印度梨形孢能够促进营养物质的吸收，提高植物的产量，诱导植物产生多种对生物胁迫以及非生物胁迫的抗性［28-31］。本研究利用印度梨形孢定殖油菜，调查大棚拟自然环境下萝卜蚜在有印度梨形孢定殖油菜和无印度梨形孢定殖油菜上的数量差异，并通过实验室萝卜蚜双向选择试验验证调查结果，同时分析油菜挥发性物质的变化情况和萝卜蚜对各差异挥发物成分的选择反应，旨在探究印度梨形孢定殖油菜对蚜虫选择油菜寄主的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株与油菜品种 印度梨形孢由德国耶拿大学Ralf Oelmüller教授惠赠；油菜为高油605（甘蓝型）种子购于浙江杭州勿忘农种业股份有限公司（浙江大学农学系选育）。

1.1.2 印度梨形孢的准备 用打孔器（直径为5 mm）在活化一周的印度梨形孢菌落边缘打孔后，挑取菌丝块置于KM培养基中，于25℃、黑暗条件下培养5 d，备用。将KM培养基上培养的印度梨形孢菌落用5 mm的打孔器打孔，菌丝块置于含PNM 培养基的130 mm×130 mm 的方形培养皿中培养一周（25℃，黑暗），处理放两片菌丝块（在培养皿对角线的1/4处，并使两菌块在两条不同的对角线上），对照则不加菌丝块。

1.1.3 油菜苗的准备 选取外形饱满、大小均匀的油菜种子，用70%乙醇处理2 min后，无菌水冲洗1次，再用2%的次氯酸钠浸泡消毒10 min，无菌水反复冲洗数次后，置于MS培养基平板上，平板置于25℃光照培养箱［32］。萌发3-4 d后选取长势一

致的油菜幼苗（根长约2 cm）分别置于培养印度梨形孢1周的PNM 平板上，每个平板放置3株苗，并使幼苗的根基部距离菌块约1 cm，对照PNM平板同样放置油菜幼苗3株，将各培养皿置于22℃/16℃（白天/黑夜），16 L/8 D光暗周期，光照强度为80 μmol/L/m2/s的培养箱中共培养2周［33］。印度梨形孢在油菜根部的定殖检测根据Rai等［34］的方法。待印度梨形孢成功定殖到油菜根部后，将油菜幼苗移至含200 g基质（草炭∶珍珠岩∶蛭石=4∶1∶1）的盆（120 mm×100 mm）中，在（25±1）℃、12 L/ 12 D光暗周期的培养箱中培养，每2 d浇水200 mL，待植株长到6叶期时进行油菜挥发性物质的提取和萝卜蚜双向选择试验。

1.1.4 萝卜蚜的饲养 萝卜蚜取自浙江杭州，饲养在甘蓝上并置于40 cm×40 cm×70 cm的纱网笼中，纱网笼放置在（25±1）℃，相对湿度60%-70%，12L/12D光暗周期的人工气候室中。

1.2 方法

1.2.1 大棚环境和实验室环境下蚜虫双向选择试验 四月下旬，取有印度梨形孢定殖的油菜和无印度梨形孢定殖的油菜各5盆（每盆一株），交叉置于大棚相同的自然环境下，30 d后调查油菜上的蚜虫数。

实验室环境下，取定殖有印度梨形孢的油菜和无印度梨形孢定殖的油菜各1株放入40 cm×40 cm×70 cm的纱网笼对角线的两端，后将30头经过5 h饥饿处理的无翅成蚜放入纱网笼中心位置，使其到两株油菜的距离相等。并将纱网笼放入温度（25±1）℃，相对湿度60%-70%，光照12L∶12D的温室中。24 h后统计油菜上蚜虫的数量，试验重复5次。

1.2.2 顶空动态吸附装置收集油菜挥发物 挥发物动态吸附装置：参照Turlings等［24］的方法自行设计，杭州常盛科教器具厂生产。空气流由空气压缩机产生，先经过活性炭过滤、再经过饱和食盐水加湿后，以400 mL/min进入放有油菜（油菜盆用锡纸包住装土部分）的味源缸（内径16 cm，高35 cm），经过油菜后的气流通过容器底部的出气口流经装有30 mg Super Q吸附剂的吸附管后排出。每次提取时间为24 h。然后用200 μL正己烷淋洗吸附剂，淋洗液保存于1.5 mL样品瓶中。将2 μL浓度为10-4g/mL的乙酸壬酯加入淋洗液中作为内标，淋洗液存于-20℃的冰箱中备用。每次收集完挥发物后剪取植物地上部分，称量鲜重。每组处理6个重复。所有的挥发物提取均在人工气候室内进行（温度25±1℃，相对湿度60%-70%，光照12L∶12D）进行。

1.2.3 挥发物的GC-MS分析鉴定 收集到的挥发物用气相色谱-质谱联用仪（Agilent 6890N GC/5975B MSD）进行定性和定量分析。HP-5MS毛细管柱（极性，柱长30 m，内径0.32 mm，膜厚0.25 μm）；不分流进样；40℃（3 min）-5℃/min-110℃（5 min）-2℃/min-180℃（15 min）-5℃/min-250℃（5 min）。以99.999%的高纯氦气作为载气，流量1.0 mL/min。质谱条件：电离方式EI，电离电压70 eV，离子源温度200℃，电子倍增器电压1 340 V，扫描质量范围50-550 aum；扫描速度1 286.1 amu/s 和3.68 scan/s；开始时间为2.5 min。

95% 的 nonanal购 自 Fluka Production GmbH（Buchs，Swizerland）；98% camphor，95% ρ-cymene，90% β-caryophyllene和 85% terpinolene购 自 Tokyo Chemical Industry Co.（Tokyo，Japan）；99.5% decanal购自Dr. Ehrenstorfer GmbH（Augsburg，Germany）；97% α-pinene，90% myrcene，90% cedrene和90% βthujene购自Sigma-Aldrich Co.（St.Louis，MO，USA）。其他没有标准品的化合物通过 National Technical Information Services（NIST）进行鉴定。

1.2.4 四扇区嗅觉仪测定萝卜蚜对挥发物的选择反应 根据刘婷等［35］的方法，用高为15 cm，底部直径为50 cm的pp材质不透光的塑料盆，在盆正中画直径为10 cm的圆形区域，作为蚜虫释放区。剩余区域均匀分为4个扇形区域。每个扇形区域边缘中央位置钻一个直径为1 cm的孔，放置样品。在每个样品孔的上方5 cm处的盆壁上钻直径为1 cm的进气孔，气流经活性碳过滤，蒸馏水加湿后通过进气孔进入盆中。释放区中央钻1个直径1 cm的孔与抽气泵相连。各挥发物标准品用液体石蜡稀释10倍后，取10 μL滴到滤纸上并将滤纸放入1.5 mL的离心管后将离心管插入样品孔中，同一对角线上的两个孔中放入装有处理样品的离心管，另一组对角线上的

孔中放置装有液体石蜡处理的滤纸的离心管。在离心管边各放上2 cm直径的油菜叶片叶碟后，将30头饥饿处理5 h的活泼蚜虫放入圆形释放区内，盖上盖子，泵以200 mL/min的吸力抽气，形成微气流。15 min后打开盖子观察记录处理区和对照区的蚜虫数量，释放区的蚜虫视为未做出选择反应，如果留在释放区的蚜虫数大于5头则重新测定。每次测定完成后，清除蚜虫和油菜叶碟，取出离心管，用电吹风均匀吹扫盆内壁5 min，并将盆水平旋转90，更换样品和蚜虫后进行下一次测定。每组挥发物测定5次，发现处理和对照存在差异，再重复测定5次。

2 结果

2.1 调查大棚拟自然环境下油菜上萝卜蚜数量与

实验室人工环境下蚜虫双向选择试验结果

调查统计大棚拟自然环境下各油菜上蚜虫的数量，得到无印度梨形孢定殖油菜上的蚜虫数为146±51.2（头），有印度梨形孢定殖的油菜上的蚜虫数为36.4±13.7（头）（图1，图2），经SPSS独立样本t检验得t=-4.620，P=0.007，两者差异极显著。实验室人工环境下无印度梨形孢定殖油菜上的蚜虫数为23±1.6（头），有印度梨形孢定殖油菜上的蚜虫数为5.2±1.3（头）（图2），SPSS软件独立样本t检验得t=-30.527，P＜0.0001，同样两者之间差异极显著。实验室人工环境下得到的结果与大棚拟自然环境下调查结果相一致，均为有印度梨形孢定殖的油菜上蚜虫的数量显著低于无印度梨形孢上蚜虫的数量。

图1 萝卜蚜在不同处理油菜上的分布情况

图2 大棚拟自然环境下与实验室人工环境下萝卜蚜在不同油菜上的分布情况

2.2 不同处理油菜挥发物的鉴定

利用顶空动态吸附装置收集有印度梨形孢定殖与无印度梨形孢定殖油菜的挥发物，并通过气相色谱-质谱联用仪比较分析两者之间的差异。发现两种油菜在挥发物的种类上没有差别，但在单位时间内释放的挥发物总量上存在显著差异。鉴定到的挥发物共21种（表1），其中两种不同处理油菜释放的6种挥发物的量存在显著差异，分别为 α-pinene、terpinolene、β-thujene、camphor、cedrene 以及 β-caryophyllene，图3表示的是这6种物质分子结构和气相色谱图。每100 g共生体油菜每小时释放量最大的是β-thujene，释放量为103.17 ng，是对照油菜释放量的6.4倍，共生体油菜释放量最少的是α-pinene，释放量为2.22 ng，是对照油菜释放量的3.6倍，另外共生体油菜释放的terpinolene 的量是对照油菜的7.1倍，camphor 的量是对照油菜的4.1倍，α-cedrene的量是对照油菜的1.8倍，β-caryophyllene的量是对照油菜的2.4倍。

2.3 萝卜蚜对挥发物标准品的选择反应测定

四扇区嗅觉仪生物测定装置测定α-pinene、terpinolene、β-thujene、camphor、cedrene以及β-caryophyllene对萝卜蚜的作用。经SPSS软件配对t检验分析表明，α-pinene对萝卜蚜有显著的吸引作用（t=14.329，P＜0.000 1），而 camphor 对萝卜蚜有显著的驱避作用（t=-18.735，P＜0.01）。所以，又以

camphor与α-pinene 浓度比为2∶1的混合物对萝卜蚜进行试验，发现 camphor与α-pinene浓度比为2∶1的混合物对萝卜蚜也有显著的驱避效果（t=-11.11，P＜0.000 1）（图4）。

表1 有印度梨形孢定殖与无印度梨形孢定殖油菜差异性挥发物组分的定性定量分析

图3 油菜挥发物的气相色谱图

图4 萝卜蚜对不同植物挥发物的选择反应测定结果

3 讨论

大棚拟自然环境下调查有印度梨形孢定殖和无印度梨形孢定殖油菜上蚜虫的数量，以及实验室人工环境下蚜虫选择油菜寄主的试验结果表明，有印度梨形孢定殖的油菜能对萝卜蚜产生显著的趋避作用。后续通过顶空动态吸附装置收集挥发物并经GC-MS分析后，我们发现印度梨形孢定殖油菜后油菜释放的挥发物种类没有变化，但是单位时间内释放的挥发物的总量发生显著变化，而且发生显著变化的主要为单萜类和倍半萜类物质，分别是α-pinene、terpinolene、β-thujene、camphor、cedrene以及β-caryophyllene。有文献报道单萜类物质 α-pinene、terpinolene、camphor、limonene、citronellal、cireonellol 和 thymol 等是趋避节肢动物的主要成分［36-38］；倍半萜类化合物β-caryophyllene对节肢动物也有很强的驱避性［39］。另外（E）-β-法尼烯作为蚜虫报警信息素，能够对蚜虫产生趋避作用［40］，linalool［20］和camphor［35］也能够对桃蚜（Myzus persicae）起趋避作用；α-pinene 对蚜虫则具有引诱作用［41］。内生真菌虽然不会引起植物产生病害症状，但是定殖植物后能够影响植物释放的挥发性物质的种类和含量，从而进一步影响植食性昆虫定位寄主植物［10］。我们发现印度梨形孢定殖油菜后导致油菜释放的挥发物的量发生不同程度的变化，从而导致萝卜蚜不能正常定位油菜寄主。通过四扇区嗅觉仪研究油菜单位时间内释放量具有差异变化的挥发物组分对蚜虫的作用，我们发现起作用的不是释放量最大的 β-thujene，而是释放量最少的 α-pinene 以及释放量较少的 camphor。其中 α-pinene 能够引诱蚜虫，camphor 则趋避蚜虫，这与前人的研究相一致，此外 camphor 和 α-pinene 以2∶1的浓度混合后也能对蚜虫产生趋避效果。所以我们推断印度梨形孢定殖油菜后对蚜虫产生的趋避作用，可能是因为油菜释放的樟脑的量显著提高所致。

印度梨形孢作为植物根部内生真菌，有关其促进植物生长发育，提高植物营养成分以及增强植物抗病能力方面的报道很多［28-31］，而关于印度梨形孢定殖植物对植食性昆虫影响方面的报道较少，Barazani等［42］发现印度梨形孢及其近似种Sebacina vermifera接种烟草后降低对烟草天蛾Manduca sexta的抗性。而本研究表明印度梨形孢定殖油菜对蚜虫显著的趋避作用能够有效控制蚜虫在油菜上的种群数量。所以，本研究为印度梨形孢影响植食性昆虫选择寄主植物提供了有效的信息，更重要的是为印度梨形孢在植物虫害生物防治方面的应用提供了支持。

4 结论

本研究发现内生真菌印度梨形孢定殖油菜根部后能够提高油菜释放的α-pinene、terpinolene、β-thujene、camphor、cedrene、β-caryophyllene等 6种挥发物的含量，其中α-pinene能够对萝卜蚜起吸引作用，camphor则对萝卜蚜起驱避作用，两者的混合物同样能够对萝卜蚜产生驱避作用。所以认为，印度梨形孢定殖油菜后提高油菜释放的camphor的量，从而对萝卜蚜产生驱避作用。

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（责任编辑 马鑫）

Influence of Piriformospora indica on Host Plant Selection by Aphid Lipaphis erysimi（Kaltenbach）

Liu Jinhua Wang Ting Gao Qikang
（Instituteof Insect Sciences，Zhejiang University，Hangzhou 310058）

In order to confirm the influence of Piriformospora indica on host plant selection of L. erysimi. Aphid dual-choice assay was taken under greenhouse and artificial control environment and the amounts of aphids on the P. indica-colonized B. napus was significantly less than the P. indica-free B. napus. Volatiles emitted by plants collected by dynamic headspace systems, the quality and quantitative differences of volatiles emitted by B. napus were analyzed through GC-MS. The result indicated that P. indica inoculated B. napus and P. indica-free B. napus had the same volatiles, but the quantity of total volatiles, α-pinene, terpinolene, camphor, β-thujene, cedrene and β-caryophyllene emitted by B. napus with P. indica were significantly higher than P. indica-free B. napus in unit time. Through the four-sector olfactomete method, we confirmed that the α-pinene significantly attracted the L. erysimi, while the camphor significantly repelled the L. erysimi. And the mixture of camphor and α-pinene（2∶1）was also significantly repelled the L. erysimi. Terpinolene, β-thujene, cedrene and β-caryophyllene had no effect on the L. erysimi.

Piriformospora indica Lipaphis erysimi Host plant selection Volatile

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.022

2014-05-14

刘金华，男，硕士，研究方向：农业昆虫与害虫防治；E-mail：kinghliu@126.com