应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒

王少杰王廿师迎春胡晓艳周涛

（1.中国农业大学植物病理学系，北京 100193；2.北京市植物保护站，北京 100029；3.北京市农业技术推广站，北京 100029）

应用深度测序技术鉴定平菇球形病毒

王少杰1王廿1师迎春2胡晓艳3周涛1

（1.中国农业大学植物病理学系，北京 100193；2.北京市植物保护站，北京 100029；3.北京市农业技术推广站，北京 100029）

旨在鉴定采集于北京顺义的畸形平菇样品中的病毒，提取总RNA，构建小RNA库，对小RNA库进行深度测序。测序结果表明，与平菇球形病毒（Oyster mushroom isometric virus，OMSV）基因组序列（NC_004560.1）匹配的小RNA共有3 075条，分布在OMSV基因组的不同位置，形成一些热点区域。经拼接，获得了3条长度大于500个核苷酸的序列。根据其中覆盖OMSV外壳蛋白（Coat protein，CP）基因的序列（seq22）中相对保守区域，设计引物，利用RT-PCR扩增获得cp基因部分序列。序列比对表明，其与OMSV相应区域序列相似度为91%，证实了OMSV在畸形平菇样品中的侵染。同时，将深度测序结果与现有4种siRNA预测软件的预测结果进行比较，发现测序结果与软件预测结果之间存在差异，讨论了这一差异出现的原因。

平菇 深度测序 平菇球形病毒 小干扰RNA 重叠群

平菇（Pleurotus ostreatus），又名糙皮侧耳，是我国中原地区种植量最大的食用菌之一［1］。在平菇菌种繁育、种植过程中会受到一些病毒侵染为害，导致平菇子实体畸形，严重时造成不发菇，导致产量和品质下降［2］。目前，对食用菌等真菌中病毒的检测、鉴定、新病毒的发现等通常采用提取双链RNA（double strand RNA，dsRNA）的方法，该方法所需样品多，过程复杂，需经反复试验和优化才能获得高质量的dsRNA用于序列测定，限制了相关领域的研究。

深度测序技术鉴定病毒是近几年快速发展起来的一项技术［3］。运用深度测序技术鉴定病毒的理论

基础是RNA干扰机制。20世纪末，研究人员发现生物体内某些RNA分子能够通过某一特定机制降低相应基因的表达水平，这一特定机制为RNA干扰机制［4］。RNA干扰作为寄主的一种防御机制，广泛地参与到寄主对抗各种病原物侵染的过程中。在寄主与病毒的互作中，病毒复制过程中产生的dsRNA被寄主的某些特殊的内切核糖核酸酶切割成小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA），这些siRNA引导寄主体内AGRONAUTE蛋白沉默与上述siRNA序列互补的病毒RNA［5］。参与沉默病毒RNA的这种siRNA被称为病毒衍生的小干扰RNA（virusderived small interfering RNA，vsiRNA），vsiRNA之间在序列上有重叠，因此可以被组装成连续的片段，这些连续的片段与相应病毒的序列相同或者相似［6，7］。将vsiRNA的上述特性与深度测序技术相结合后，即可应用深度测序技术鉴定已知病毒及某些新病毒了［8-10］。这一鉴定病毒的方法适用于多种生物体内多种病毒的鉴定［8，11］。

平菇球形病毒（Oyster mushroom spherical virus，OMSV）是一种侵染为害平菇的正单链RNA病毒，于2003年首先被韩国科学家发现并分离［12］。OMSV病毒颗粒为等轴球形，直径约为27 nm，基因组全长约为5.7 kb，5'-末端没有帽子结构，3'-末端有多聚腺苷酸尾巴，编码7个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF）。目前已知其中两个ORF的编码产物，分别为病毒的外壳蛋白（Coat Protein，CP）和RNA依 赖 性RNA聚 合 酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDRP），其他ORF编码的氨基酸序列与GenBank中已知的氨基酸序列没有同源性［2，12］。平菇被OMSV侵染后，出现菌丝退化、菌柄短粗等症状［12］，这些症状使平菇经济价值降低，从而导致平菇种植业损失严重。检测鉴定平菇球形病毒，特别是检测平菇菌种是否携带该病毒，对生产实践具有重要意义。

本研究应用深度测序技术，鉴定子实体表现畸形症状平菇样品中的OMSV，并分析与OMSV序列匹配的siRNA的分布规律和拼接序列与参比序列的比对结果，旨在为其他种类的食用菌中的病毒检测鉴定提供借鉴和参考，并为深入研究OMSV与平菇的互作过程提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

平菇样品采集于北京市顺义区。样品表现症状为菌柄短粗，菌盖褐化程度严重，子实体畸形变小，生长受到阻滞（图1）。

图1 疑似被病毒侵染的平菇

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取和质量检测 采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ca#t. AM1560 Austin TX，US）并根据说明书进行样品总RNA的抽提纯化，之后对抽提纯化后的总RNA进行质量检测。

1.2.2 深度测序和序列拼接 委托上海伯豪生物技术有限公司进行深度测序（illumina solexa，HiSeq 2500 System）。测序样本文库构建时，按照“TruSeq Small RNA Sample Preparation Guide”对纯化后的样品总RNA依次进行3'端接头连接、5'端接头连接，反转录、扩增、cDNA纯化等步骤，从而完成测序样本文库的构建。测序后，筛选出与病毒库序列匹配的siRNA，进行预处理，去除siRNA两侧接头序列和低质量序列标签（reads）。随后使用软件Clc Genomics Workbench（CLC bio，版本6.5）进行序列拼接，软件运行时长度参数设置为200，其他参数均为软件默认值。siRNA序列信息上传到GenBank数据库（序列号为SRR1395331）。

1.2.3 拼接序列比对 使用本地化的Blast软件（ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/ LATEST，版本号2.2.29），进行拼接序列的比对，序列比对时所使用的数据库为从NCBI网站（www. ncbi.nlm.nih.gov）下载的病毒数据库（时间为2014年3月2日，共有1 498 320个条目，均以FASTA格式保存）。

1.2.4 vsiRNA及拼接序列seq22的分析 使用Microsoft office软件，利用数理统计的方法，分析与OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配的siRNA在病毒基因组上的分布规律，以及拼接序列与OMSV序列的比对结果。

1.2.5 PCR验证 根据序列核酸比对结果，使用软件DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）设计引物OMSV4910F：5'-TACCCCCCCAGGATCTCAAGCTTCT-3'和OMSV5556R：5'-TGAAAGCGCGTCCATCAGAACCATTC-3'，扩增cp基因部分片段，预期产物大小为646 bp。PCR扩增程序为：95℃起始变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火35 s，72℃延伸40 s，35个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（北京天根生化科技公司）回收相应大小的PCR产物。回收产物连接到pMD18-T载体（大连宝生物工程公司），阳性克隆由北京华大基因科技有限公司进行序列测定。使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）对测序结果进行序列比对。

1.2.6 深度测序的结果与预测软件结果的比较 用4种siRNA预 测 软 件（siDESIGN Center，http：// www.thermoscientificbio.com/design-center/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）对OMSV基因组产生siRNA分布情况进行预测，并将深度测序数据中与OMSV匹配的siRNA分布情况与软件预测结果的分布情况进行比较。

2 结果

2.1 平菇样品总RNA质量

提取的平菇样品总RNA经过质量检测，A260/A280=2.08，符合分离小RNA和建立cDNA文库的标准（表1）。

表1 平菇病害样品总RNA质检信息

2.2 与OMSV序列匹配的 siRNA分析

对siRNA测序结果进行分析，去除接头序列和低质量标签（reads），使用本地化BLAST与病毒基因库进行比对，发现与病毒序列匹配的siRNA有5 409条，其中有3 075条siRNA与OMSV的序列（ID：NC_004560.1）匹配。按照vsiRNA的来源进行分析，发现由OMSV正链形成的siRNA有2 029条，占总数的66%；由OMSV互补链形成的siRNA有 1 046条，占总数的34%，即由病毒正负链产生的siRNA比例接近2∶1。

对5'端起始核苷酸进行分析，发现以腺嘌呤核糖核苷酸（A）为起始核苷酸的siRNA有674个，占总数的22%；以胞嘧啶核糖核苷酸（C）为起始核苷酸的siRNA有1 073个，占总数的35%；以鸟嘌呤核糖核苷酸（G）为起始核苷酸的siRNA有666个，占总数的22%；以尿嘧啶核糖核苷酸（U）为起始核苷酸的siRNA有660，占总数的21%（图2）。

图2 5'端起始核苷酸不同的vsiRNA之间的比例

按照OMSV上ORF的分布情况进行分析（以vsiRNA的5'端的起始位置作为分类标准），发现有编码CP的区域产生了最多的vsiRNA，是产生vsiRNA的热点区域（表2）。

2.3 与OMSV序列匹配的拼接序列分析

使用Clc Genomics Workbench软件对与病毒序列匹配的siRNA进行序列拼接，拼接序列经过本地化的blast比对后，其中有3条拼接序列与OMSV序列（ID：NC_004560.1）匹配（表3），与OMSV序列匹配上的序列总长度为5 096 nt，占OMSV序列的88%。

选取长度最大的拼接序列seq22进行详细分析。Seq22长度为2 747 nt，与OMSV序列（NC_004560.1）的核酸序列相似度为79.69%。按ORF的分布情况，将seq22序列分成4个区域，这4个区域分别参与

编码RDRP、14.5 kDa、CP和23 kDa 4种蛋白。

表2 vsiRNA在病毒基因组上的分布

表3 拼接序列与平菇球形病毒基因组的匹配及相似度

使用DNAMAN（版本6.0，LynnonBiosoft）软件从核酸序列和氨基酸序列水平比对seq22和OMSV基因组序列（ID：NC_00-4560.1）对应区域的相似性（表4）。比对结果表明，在编码RDRP和CP的ORF区域，seq22与OMSV基因组参考序列核酸序列之间相似性较低，但氨基酸序列之间相似性较高；在编码14.5 kD蛋白和23 kD蛋白的ORF区域，seq22与OMSV基因组参考序列核酸序列之间和氨基酸序列之间相似性均较低。

表4 拼接序列seq22与OMSV基因组序列相应区域的核苷酸和氨基酸相似性对比

2.4 RT-PCR验证

根据序列拼接结果，设计引物OMSV4910F和OMSV5556R，利用RT-PCR扩增cp基因部分序列（图3）。经测序和序列分析，该PCR产物为OMSV的部分cp序列，与OMSV标准序列（ID：NC_004560.1）的cp基因核酸序列相似度为91%，与相应拼接序列（seq22）的核酸序列相似度为99%。

图3 OMSV cp基因PCR检测电泳图

2.5 深度测序与预测软件分析siRNA分布的比较

将深度测序数据中与OMSV匹配的siRNA的分布情况与4种siRNA预测软件（siDESIGN Center，http：//www.thermoscientificbio.com/designcenter/；DSIR，http：//biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR. html；OptiRNA，http：//optirna.unl.edu/；WI siRNA Selection Program，http：//sirna.wi.mit.edu/）的预测结果的分布情况进行比较后发现，实际情况与预测结果存在较大差异（图4），预测结果表明编码RDRP的区域是siRNA产生的热点区域，而测序结果中编码CP的区域是siRNA产生的热点区域。

图4 预测软件结果与深度测序结果的比较

3 讨论

通过深度测序鉴定病毒是近几年来快速发展的病毒鉴定新技术，已在多个物种中应用。与常规鉴定病毒的技术（如PCR）相比，应用深度测序技术鉴定病毒的方法（以下简称深度测序）具有一些优势，特别是在发现新病毒方面。深度测序可以病毒序列等信息未知的情况下，只需提取总RNA，分离siRNA，构建文库后进行测序，经序列比对即可对某一或一群生物体内的几乎所有病毒进行发现和鉴定，灵敏度高，适用性强，获得的信息丰富；缺点是操作过程复杂，技术要求高，成本高。而常规应用PCR 和RT-PCR检测和鉴定病毒的方法（以下简称RT-PCR）需要病毒的基因组部分序列，适用于研究比较清楚的病毒，检测针对性强，一次反应仅能检测一种至多种病毒，如果病毒序列变异大，极易出现错误结果，优点是已经普及，成本低。

目前，对食用菌病毒研究相对较少，可以利用的序列信息也较少。食用菌栽培生产中有多种不正常生长表现，多为子实体畸形或者不发菇。利用常规的分子生物学技术，如RT-PCR方法、酶联免疫方法和提取双链RNA的方法对病毒进行检测，由于序列特异性强、检测灵敏度低等缺点，难以对食用菌病毒做到全面检测和鉴定，特别是尚未有报道的病毒［13］。

由OMSV正链形成的vsiRNA与由OMSV基因组互补链形成的vsiRNA之间的比例为2∶1。鉴于OMSV为正单链RNA病毒，因此推测OMSV衍生出的双链和自身单链均是vsiRNA的主要来源。这可能是由于OMSV的正单链RNA自身形成了较多的发卡等二级结构。同时，平菇中以碱基C为5'端起始核苷酸的vsiRNA数量明显多于其他vsiRNA，这可能是由于RNA干扰过程中，起相关作用的酶具有偏好性的缘故。

经过分析vsiRNA在OMSV序列上的分布规律，发现编码CP的区域是siRNA产生的热点区域。主要原因可能是因为该区域产生的siRNA具有较高的沉默效率，也有可能是因为其他未知因素。为了证实这一推测，将深度测序数据中与OMSV匹配的siRNA的分布情况与4种siRNA预测软件的预测结果的分布情况进行比较，结果表明软件预测RDRP区域为siRNA产生热点区域，与深度测序结果差异较大。由于预测软件的算法是主要基于靶向序列的一级结构［14-16］，因此可以推断编码CP的区域成为热点区域的主要原因有可能是一级结构以外的其他原因。这些原因有可能与功能有关，CP是在病毒与寄主互作中的重要因子，寄主的防御系统将沉默的重点区域设定为编码CP的区域，有助于寄主抵御病毒。除了功能原因以外，二级结构也有可能是形成热点区域的重要原因［17，18］。

在分析拼接序列seq22的不同区域是否存在同义突变时，发现了两个特殊区域，分别参与编码14.5 kD蛋白和23 kD蛋白。与OMSV编码RDRP、CP区域不同的是编码14.5 kD蛋白和23 kD蛋白核酸序列的变异直接导致氨基酸序列的改变，这种改变有可能使得这些区域编码的产物功能发生变化。因此这些区域编码的产物有可能在病毒与环境的互

作中起重要作用［19，20］。但由于这两个区域编码的产物功能未知，仍有待于进一步试验证明。

4 结论

本研究应用深度测序技术鉴定了平菇样品中的平菇球形病毒（OMSV），并使用RT-PCR的方法进行了验证；利用生物信息学技术初步分析了与OMSV有关的siRNA在病毒基因组上的分布情况。

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（责任编辑 马鑫）

Identification of Oyster Mushroom Spherical Virus in Pleurotus ostreatus by Deep Sequencing

Wang Shaojie1Wang Nian1Shi Yingchun2Hu Xiaoyan3Zhou Tao1
（1. College of Agriculture and Biotechnology，China Agriculture University，Beijing 100193；2. Beijing Plant Protection Station，Beijing 100029；3. Beijing Agricultural Technical Extension Station，Beijing 100029）

To identify viruses in malformed Pleurotus ostreatus samples collected in Shunyi district in Beijing, deep sequencing of small RNA from total RNA was performed. Consequently, there were 3 075 small interfering RNAs（siRNAs）pairing to the complete sequence of Oyster mushroom isometric virus（OMSV）（NC_004560.1）. These siRNAs were located in most regions on genome of OMSV, some of which formed hot-spots. By putting these siRNAs together, three contigs with length more than 500 nucleotides were assembled. According to the sequence of one of these contigs, seq22, a pair of primers was designed to amplify partial coat protein gene via RT-PCR. The results showed that cloned sequence was similar to the

equence and to the contig with identities of 91% and 99%, respectively. These results confirmed OMSV in the collected mushroom samples. Meanwhile, the related data acquired from deep sequencing was compared to the predicted siRNAs obtained by four softwares, showing that they were different from each other. The difference was discussed.

Pleurotus ostreatus Deep sequencing Oyster mushroom spherical virus siRNA Contig

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.014

2014-05-04

2013年食用菌创新团队岗位专家工作经费（PXM2013_036203_000055）

王少杰，男，硕士研究生，研究方向：植物病毒；E-mail：wangshaojiestrong@163.com

周涛，男，副教授，研究方向：植物病毒；E-mail：taozhoucau@cau.edu.cn

师迎春，女，研究员，研究方向：蔬菜和食用菌病虫害；E-mail：shiych@126.com