农药助剂对蚯蚓(Eisenia foetida)的急性毒性

张灿光，杜军辉,2，李华,2，李北兴，刘峰 ,2,*

1. 山东农业大学植物保护学院 农药毒理与应用技术省级重点实验室，泰安 271018 2. 山东农业大学农药环境毒理研究中心，泰安 271018

农药助剂伴随着农药剂型的发展而逐渐被开发和应用[1]。助剂的大量使用，不仅增加药剂成本，而且会随着农药的使用撒入田间后进入土壤和河流，污染环境[2-3]。然而由于多数农药助剂对靶标生物没有直接的活性[4]，以致忽视了对农药助剂的环境毒理研究和生产管理；特别是有关农药助剂的生态环境毒性，国内鲜有文献报道。近年来，随着环保意识的增强，人们逐渐从关注农药对环境非靶标生物的影响方面，转移到研究一些高风险溶剂或分散剂等助剂本身的环境毒性[5-6]。

我国已有学者对表面活性剂的毒理学及降解规律做了基础性研究[1]，但是关于农用表面活性剂对土壤生物的影响方面的相关报道较少，关于对土壤生物的生态毒理效应的研究更不够深入。蚯蚓是陆生生物量最大的一类土壤动物，通常被视为土壤动物区系的代表类群而被用于指示、监测土壤污染。这主要是由于蚯蚓在土壤物理性质改良和植物营养循环方面中起着举足轻重的作用[7-11]。针对蚯蚓的生态毒理学研究不仅可反映所测污染物的毒性效应，还可反映出土壤的污染状况，同时还可为保护整个土壤动物区系的安全阈值的确定提供数据支持[12]。因此，蚯蚓作为受试生物用于土壤污染的生态风险评价越来越受到重视[13]。

尽管个别溶剂和分散剂对蚯蚓的毒性效应已有报道[14-15]，但所采用测定方法不一致并缺乏系统地对比研究。因此，本研究采用OECD推荐的化学品对蚯蚓急性毒性测定的标准方法[16]，测定了不同类别农药助剂对蚯蚓的急性毒性效应，旨在为科学评价农药助剂的环境影响和生态风险、指导农药制剂开发提供依据。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

非离子表面活性剂：壬基酚聚氧乙烯醚系列(TX-5、TX-7、TX-8、TX-10、TX-18、TX-30、TX-40、TX-50)，江苏省海安石油化工厂；辛基酚聚氧乙烯醚系列(OP-7、OP-10)、蓖麻油聚氧乙烯醚系列(EL-12、EL-20、EL-40、EL-80)、脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-7)、苯乙烯基酚聚氧乙烯醚(农乳600#)、失水山梨醇单油酸酯(SP-80)、失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(T-80)，邢台蓝星助剂厂；脂肪酸聚氧乙烯酯(OE-12)，辽阳奥克化学有限公司。

阴离子表面活性剂：十二烷基硫酸钠(SDS)，上海优扬实业有限公司；十二烷基苯磺酸钙(农乳500#)， ；木质素磺酸钠M-9(木钠)，木质素磺酸钙(木钙)，吉林延边石岘白麓纸业股份有限公司；亚甲基双萘磺酸钠(NNO)。

溶剂：二甲苯、甲苯、乙苯、乙醇、正丁醇、丙酮、环己酮、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)，天津市凯通化学试剂有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，天津市巴斯夫化工有限公司；油酸甲酯，济南慧丰化工有限公司；生物柴油，山东德州隆光油脂加工厂；大豆油，山东德州聚鑫化工助剂有限公司。

填料：高岭土(高岭石质量分数大于30%，河北灵寿县德润盛建材厂)；白炭黑，山东聊城运昌白炭黑有限公司；硅藻土，青岛盛泰硅业有限公司；凹凸棒土，安徽明美矿物化工有限公司；轻质碳酸钙(轻钙)，桂林金山化工有限责任公司。

生物试材：赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)，购于天津贾立明蚯蚓养殖有限公司。挑选已出现繁殖环带的健康成蚓，体重在400 mg～500 mg之间的个体用于试验，购入后在室温20 ℃条件下避光驯养。

滤纸(80 g·m-2-85 g·m-2，厚度0.2 mm左右，杭州特种纸业有限公司)；泥炭藓灰(pH值5.5-6.0，荷兰TREF集团公司)；石英砂(50-200 μm粒径的细砂质量分数大于50%，河北灵寿县德润盛建材厂)。

1.2 试验方法

1.2.1 蚯蚓毒性试验

滤纸接触法参照赵学平等[17]的方法，对OECD 207[16]的方法进行了改进。①向底部铺有一层滤纸的平底烧杯(直径9 cm×高12 cm)中加入少量去离子水，以刚浸没滤纸为宜。将蚯蚓放在滤纸上，用塑料薄膜封口，扎孔，将烧杯放入温度为(20±1) ℃，湿度为80%～85%的恒温箱中清肠24 h。②在培养皿(直径9 cm)中垫入直径11 cm的一层滤纸(滤纸包住培养皿边缘)。在水能溶解或分散的表面活性剂和溶剂，用去离子水配制母液，并设置空白对照；在水中不溶且不易分散的表面活性剂和溶剂，用乙醇及乳化剂T-80配制母液，稀释后乙醇及T-80的质量分数均不超过0.2%[6]，并设置乙醇及T-80的对照；填料研磨成10%水悬浮剂母液，其中含2% T-80，并配制2% T-80母液对照。通过预实验明确助剂有效浓度范围后，将母液以等比级差稀释成7个系列梯度浓度，取一定浓度的溶液2 mL于滤纸上，每个浓度设30个重复。后加2 mL去离子水湿润滤纸，将清肠后的蚯蚓冲洗干净，用滤纸吸去多余的水分后放入培养皿中，每个培养皿放1条蚯蚓，用塑料薄膜封口、扎孔，后置于(20±1) °C，湿度为80%～85%的恒温箱中黑暗培养，于24 h和48 h各计数1次，记录死亡数和中毒症状，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡。

按照OECD 207中的标准方法[16]配制人工土壤。泥炭藓灰10%、高岭土20%、石英砂70%，按上述比例混合均匀，后于105 °C烘干，备用。

非挥发性助剂采用OECD 207[16]中的标准人工土壤法。将母液与500 g人工土壤混匀，加入去离子水使土壤含水量为30%。将上述含助剂的人工土壤放入1 L玻璃标准瓶中，向其中放入10条蚯蚓，用塑料薄膜封口，扎孔后置于(20±1) °C，湿度为80%～85%的恒温箱中连续光照培养(光照强度为600 lx)。每种助剂设7个浓度，每浓度设3个重复，并设溶剂、空白对照。第7 d和14 d各计数1次，记录死亡数及中毒症状，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡。

挥发性助剂采用An建议的密封人工土壤法[18]。使用有底玻璃管(内径2.6 cm×高8 cm)为实验容器，根据预实验中蚯蚓不死及完全死亡的浓度，在二者之间设置正式试验浓度，并设溶剂、空白对照。称取10 g干土样品于玻璃管中，快速且均匀滴入助剂，调整水土比为1:4，迅速用铝箔纸封口。用封口膜将铝箔纸粘紧在玻璃管壁上，防止助剂挥发。待平衡24 h后，快速将土拌匀，每个玻璃管放入1条已清肠24 h的蚯蚓，再次封口，置于(20±1) °C、湿度为(75±1)%的生化培养箱中避光培养。每处理重复10次，分别于24 h、48 h记录蚯蚓死亡数及中毒症状，蚯蚓对针刺无反应判为死亡。

1.2.2 数据处理

用寇氏法计算助剂对蚯蚓的LC50值及其95%置信限，以LC50值与95%置信限是否有重叠作为判断不同种药剂毒性差异是否显著的标准[19]。采用滤纸接触法测定农药助剂对蚯蚓的毒性分级采用下面的标准[20]：LC50≤ 1.0 μg·cm-2，为剧毒级；1.0 μg·cm-2< LC50≤ 10.0 μg·cm-2，为高毒级；10.0 μg·cm-2< LC50≤ 100.0 μg·cm-2，为中毒级；100.0 μg·cm-2< LC50≤ 1 000.0 μg·cm-2，为低毒级；> 1 000.0 μg·cm-2，为微毒级。采用标准人工土壤法测定农药助剂对蚯蚓的毒性分级标准采用《化学农药环境安全评价的试验准则》中提出的标准[21]：LC50≤ 1.0 mg·kg-1为高毒级；1.0 mg·kg-1< LC50≤ 10.0 mg·kg-1为中毒级；LC50> 10.0 mg·kg-1，为低毒级。采用密封人工土壤法测定农药对蚯蚓的毒性参考前苏联制定的化学物质急性毒性经皮分级标准[22]：LC50≤ 100.0 mg·kg-1为剧毒级；100.0 mg·kg-1< LC50≤ 500.0 mg·kg-1为高毒级；501.0 mg·kg-1< LC50≤ 2 500.0 mg·kg-1为中等毒级；LC50> 2 500.0 mg·kg-1，为低毒级。

2 结果(Results)

试验期间，滤纸接触法和人工土壤法中设置的溶剂、空白对照，蚯蚓均表现正常，未见死亡。

2.1 滤纸接触法

采用滤纸接触法测定的19种非离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性，24 h时，均为中等毒性以下；壬基酚聚氧乙烯醚系列中的TX-5、TX-7、TX-8、TX-10，辛基酚聚氧乙烯醚系列中的OP-7、OP-10，脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-7，毒性较高，为中等毒性，其LC50为12.32～42.56 μg·cm-2，毒性顺序为：OP-10 > TX-5 > AEO-7 > TX-7 > OP-7 > TX-8 > TX-10；蓖麻油聚氧乙烯醚系列中的EL-12、EL-20，苯乙烯基酚聚氧乙烯醚农乳600#，为低毒，其LC50为804.0～867.4 μg·cm-2，毒性顺序为：EL-12 > EL-20 > 农乳600#；其余9种非离子表面活性剂的LC50均大于1 000.0 μg·cm-2，对蚯蚓的毒性较小(表1)。

48 h时，上述表面活性剂对蚯蚓的毒性均略有增加。辛基酚聚氧乙烯醚系列中的OP-10，毒性上升为高毒级；TX-5、TX-7、TX-8、TX-10、AEO-7、OP-7，仍为中等毒性，其LC50为28.57～39.65 μg·cm-2；EL-12、EL-20、农乳600#，为低毒，其LC50为778.5～842.5 μg·cm-2，毒性顺序均与24 h时一致(表1)。

采用滤纸接触法测定的5种阴离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性，24 h时，SDS毒性最高，其LC50为7.329 μg·cm-2，为高毒级；农乳500#的LC50为50.48 μg·cm-2，属中等毒性；其余3种阴离子表面活性剂的LC50均大于1 000.0 μg·cm-2，对蚯蚓的毒性较小；毒性顺序为SDS >农乳500#> 木钠、木钙、NNO(表2)。

48 h时，上述表面活性剂对蚯蚓的毒性均略有增加。SDS为高毒，LC50为6.575 μg·cm-2；农乳500#为中等毒性，LC50为41.89 μg·cm-2；毒性顺序与24 h时一致(表2)。

表1 采用滤纸接触法测定19种非离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性Table 1 Acute toxicity of nineteen nonionic surfactants to earthworm by using contact filter method

注：— 表示在本研究设定的浓度范围内未见致死作用，下同。A：壬基酚聚氧乙烯醚系列；B：辛基酚聚氧乙烯醚系列；C：蓖麻油聚氧乙烯醚系列；D：脂肪醇聚氧乙烯醚；E：脂肪酸聚氧乙烯酯；F：失水山梨醇单油酸酯；G：失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚；H：苯乙烯基酚聚氧乙烯醚。

Note: — indicated that there was no death in the tested dosages, the same below. A: Nonylphenol polyoxyethylene ether surfactants; B: Octaphenyl polyoxyethyiene ether surfactants; C: Polyoxyethylene ether castor oil series; D: Fatty alcohol polyoxyethylene ether surfactants; E: Polyoxyethylene esters of fatty acids surfactants; F: Sorbitan monooleate; G: Sorbitan monooleate polyoxyethylene ether; H: Styryl phenol polyoxyethylene ether surfactants.

表2 采用滤纸接触法测定5种阴离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性Table 2 Acute toxicity of five anionic surfactants to earthworm by using contact filter method

采用滤纸接触法测定的13种溶剂对蚯蚓的急性毒性，24 h时，正丁醇的毒性最高，LC50为7.142 μg·cm-2，为高毒级；环己酮、乙苯、二甲苯、甲苯，属中等毒性，LC50为39.03～60.79 μg·cm-2；其余8种溶剂的LC50均大于1 000.0 μg·cm-2，对蚯蚓的毒性较小；毒性顺序为：正丁醇 > 环己酮 > 乙苯 > 二甲苯 > 甲苯(表3)。

48 h时，上述溶剂对蚯蚓的毒性均略有增加。正丁醇为高毒，LC50为6.587 μg·cm-2；环己酮、乙苯、二甲苯、甲苯，为中等毒性，LC50为36.47～57.62 μg·cm-2；毒性顺序与24 h时一致(表3)。处于中等毒性及以上时，蚯蚓很快出现蚓体变软、挣扎扭曲、伸长、环带肿大充血、向四周爬行、身体断裂和糜烂等症状。

采用滤纸接触法测定的5种填料(高岭土、白炭黑、硅藻土、凹凸棒土、轻质碳酸钙)对蚯蚓的急性毒性，24 h及48 h时，其LC50均大于1 000.0 μg·cm-2，对蚯蚓的毒性较小。

2.2 人工土壤法

采用标准人工土壤法测定的19种非离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性，7 d时，壬基酚聚氧乙烯醚系列中的TX-5、TX-10毒性较高，且TX-5毒性高于TX-10，其LC50为910.2～2 835.5 mg·kg-1；其余17种非离子表面活性剂的LC50均大于5 000 mg·kg-1(表4)。

14 d时，上述表面活性剂的毒性均略有增加。壬基酚聚氧乙烯醚系列中的TX-5、TX-7、TX-8、TX-10毒性较高，其LC50为876.5～2 786.6 mg·kg-1，TX-7、TX-8的毒性上升较快，毒性顺序为：TX-5 > TX-7 > TX-8 > TX-10；其余15种非离子表面活性剂的LC50均大于5 000 mg·kg-1，所测19种非离子表面活性剂均为低毒(表4)。

表3 采用滤纸接触法测定13种溶剂对蚯蚓的急性毒性Table 3 Acute toxicity of thirteen solvents to earthworm by using contact filter method

采用标准人工土壤法测定的5种阴离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性，7 d时，SDS、农乳500#的毒性相对较高，其LC50为1 227.0～2 820.1 mg·kg-1；其余3种阴离子表面活性剂的LC50均大于5 000 mg·kg-1，毒性顺序为：SDS > 农乳500#> 木钠、木钙、NNO(表5)。

14 d时，上述表面活性剂的毒性均略有增加。SDS、农乳500#的LC50为1 195.0～1 911.7 mg·kg-1；其余3种阴离子表面活性剂的LC50均大于5 000 mg·kg-1，毒性顺序与7 d时一致。所测5种阴离子表面活性剂均为低毒(表5)。

表4 采用标准人工土壤法测定19种非离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性Table 4 Acute toxicity of nineteen nonionic surfactants to earthworm by using artificial soil test method

注：— 表示在本研究设定的浓度范围内未见致死作用，下同。A：壬基酚聚氧乙烯醚系列；B：辛基酚聚氧乙烯醚系列；C：蓖麻油聚氧乙烯醚系列；D：脂肪醇聚氧乙烯醚；E：脂肪酸聚氧乙烯酯；F：失水山梨醇单油酸酯；G：失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚；H：苯乙烯基酚聚氧乙烯醚。

Note: — indicated that there was no death in the tested dosages, the same below. A: Nonylphenol polyoxyethylene ether surfactants; B: Octaphenyl polyoxyethyiene ether surfactants; C: Polyoxyethylene ether castor oil series; D: Fatty alcohol polyoxyethylene ether surfactants; E: Polyoxyethylene esters of fatty acids surfactants; F: Sorbitan monooleate; G: Sorbitan monooleate polyoxyethylene ether; H: Styryl phenol polyoxyethylene ether surfactants.

表5 采用标准人工土壤法测定5种阴离子表面活性剂对蚯蚓的急性毒性Table 5 Acute toxicity of five anionic surfactants to earthworm by using artificial soil test method

采用标准人工土壤法测定的3种非挥发性溶剂对蚯蚓的急性毒性，7 d与14 d毒性结果均为低毒，其LC50均大于5 000 mg·kg-1(表6)。

采用标准人工土壤法测定的5种填料对蚯蚓的急性毒性，7 d与14 d毒性结果均为低毒，其LC50均大于5 000 mg·kg-1。

采用密封人工土壤法测定的10种挥发性溶剂对蚯蚓的急性毒性，DMSO、丙酮、乙醇、乙腈对蚯蚓的毒性最低，其24 h-LC50和48 h-LC50均大于5 000 mg·kg-1；除上述4种溶剂外，其余6种溶剂对蚯蚓均表现出一定的急性毒性。24 h时，二甲苯、乙苯对蚯蚓的毒性最高，其LC50为202.2～329.6 mg·kg-1，属于高毒级；其次为甲苯、环己酮、正丁醇，其LC50值为520.2～823.8 mg·kg-1，属于中等毒性；而DMF对蚯蚓的毒性最低，其LC50为4 245.2 mg·kg-1(表7)。

48 h时，上述溶剂对蚯蚓的毒性均略有增加。二甲苯、乙苯、甲苯对蚯蚓的毒性较高，其LC50为181.9～453.8 mg·kg-1，属高毒级；DMF对蚯蚓的毒性最低，其LC50为4 182.3 mg·kg-1，属低毒级；6种溶剂对蚯蚓的毒性顺序为：二甲苯 > 乙苯 > 甲苯 > 环己酮 > 正丁醇 > DMF，与24 h时的毒性顺序一致(表7)。

表6 采用标准人工土壤法测定3种非挥发性溶剂对蚯蚓的急性毒性Table 6 Acute toxicity of three nonvolatile solvents to earthworm by using artificial soil test method

表7 采用密封人工土壤法测定10种挥发性溶剂对蚯蚓的急性毒性Table 7 Acute toxicity of ten volatile solvents to earthworm by using closed artificial soil test method

3 讨论(Discussion)

滤纸接触法是将蚯蚓直接暴露在一定浓度的农药环境下的实验方法，简单易行，可以初步了解化学药品的固有毒性和对土壤动物的潜在毒性。而在实际环境中，药物对蚯蚓产生的毒性不仅取决于药物的固有毒性，还与药物在土壤中的降解情况、蚯蚓体内的药物代谢动力学等因素密切相关，因此，土壤接触法更接近实际情况。在土壤接触法中，尽管自然土壤法更接近自然状况下蚯蚓接触药物的方式，但是不同地区土壤情况的差异常会降低数据的可比性。因此，本研究选择人工土壤法来比较农药助剂的毒性差异，避免不同地区土壤对毒性结果的影响[16,19]。从研究结果可以看出，采用滤纸接触法与人工土壤法测得的毒性系统偏差相近，即两种方法均具有较好的重现性；但其测得的毒性间存在一定差异，前者测得的毒性往往大于后者；如本研究中滤纸法显示SDS、正丁醇对蚯蚓高毒，而人工土壤法则分别显示为低毒和中毒；脂肪醇聚氧乙烯醚AEO-7与烷基酚聚氧乙烯醚(环氧乙烷缩合数EO<10)的毒性相近，但采用人工土壤法测得的毒性低于烷基酚聚氧乙烯醚(EO<10)。可能的原因是，滤纸法中，助剂粘附于滤纸表面，直接与蚯蚓接触，吸收速率快，吸收量大；人工土壤法中，助剂会吸附于土壤胶体和有机质上，并通过生物、光和化学氧化等途径降解，生物有效性大大降低，从而降低了蚯蚓对助剂的吸收速率[19]，毒性下降。由此可见，作为被EEC和ISO推荐的人工土壤法的测定结果比滤纸法更客观、准确，可为农药助剂对蚯蚓的毒性提供较为准确的信息[23-24]。

不同类别的助剂对蚯蚓的毒性存在较大差异，溶剂、表面活性剂的毒性相对高于填料等惰性助剂。而同一功能助剂中，不同来源或不同结构的助剂毒性差异也比较大。如农药乳油中常用的芳烃类溶剂，水乳剂和微乳剂中常用的正丁醇、环己酮等溶剂，毒性高于乙醇、生物柴油、油酸甲酯等植物源溶剂。二甲苯、乙苯、甲苯3种化合物均属于非极性麻醉型化合物。非极性麻醉型化合物引起麻醉的能力依赖于其疏水性。根据相似相溶原理，生物体细胞膜及细胞中类脂物质都会吸附麻醉型化合物，可以用辛醇-水分配系数(Kow)确定其基本的毒性[25]。二甲苯(总)、乙苯、甲苯20 °C辛醇-水分配系数logKow分别是3.15～3.20、3.13、2.69[26]，Kow越大，就越容易非选择性通过细胞膜进入生物体内而体现毒性。二甲苯对蚯蚓表现出最大的毒性，其次是乙苯，甲苯虽然有较大的水溶性，但是logKow是3种物质中最小的，导致表现出的毒性也最小。同时，说明有机污染物的生态毒性不仅与其在水中的溶解度有关，还与其理化性质及其对靶标生物的毒性机制有关[6]。本研究结果与刘尧等[6]采用自然土壤法测得的毒性基本一致。

在表面活性助剂中，起润湿和乳化作用的阴离子型表面活性剂如SDS、农乳500#，起增加渗透及润湿作用的非离子表面活性剂如烷基酚聚氧乙烯醚TX和OP系列、脂肪醇聚氧乙烯醚AEO系列助剂的直接毒性相对较高，而部分来源于天然产物的脂肪酸聚氧乙烯酯、蓖麻油聚氧乙烯醚EL系列、失水山梨醇酯及其环氧乙烷化物Span和Tween系列毒性相对较低。此外，作为分散剂使用的NNO、木钠、木钙直接和间接毒性均较低。除化合物自身毒性低外，可能也与分散剂吸附能力强[27]，更容易吸附于滤纸及土壤颗粒上，降低了蚯蚓的接触量有关。

此外，在同系列非离子表面活性剂中，当碳链长度相同时，EO越大，毒性越低；如TX-5、TX-7、TX-8和TX-10，以及EL-12、EL-20等毒性随亲水性增强而依次降低。这与李秀环等[28]测得的助剂对大型溞的毒性规律有一定的相似性。

乳油和可湿粉是目前我国生产和使用量较大的基本农药剂型，乳油中含大量的芳烃类溶剂、十二烷基苯磺酸钙及烷基酚聚氧乙烯醚类乳化剂；可湿粉中大量使用SDS等润湿剂。此外，微乳剂在我国农药新剂型中也占有较大比重，其配方含有大量的乳化、增溶表面活性剂及醇、酮等极性溶剂容易进入土壤及水体环境。因此，这些剂型的农药在田间使用时，助剂对环境生物的影响不容忽视。尽管国际上农药剂型的开发正朝着安全性强、绿色环保、价格低廉的水基性制剂和无粉尘的固体粒状制剂方向发展，在筛选新农药剂型配方时还是应注意选择和使用对环境生物影响小的农药助剂品种，同时针对老剂型，加强绿色溶剂、绿色表面活性剂的研发和推广工作，以降低对农田生态环境的影响。

致谢：感谢山东农业大学植物保护学院慕卫副教授的帮助和支持。

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