褐菖鲉肝HSC70基因的环介导等温扩增技术的建立及在石油污染剂量效应研究中的应用

莫正平，陈 荣,*，黄火清，左正宏

1. 厦门大学环境与生态学院, 近海海洋环境科学国家重点实验室 厦门 361102 2. 厦门大学生命科学学院，厦门 361102

石油污染是各种海洋污染中发生频率最高、分布面积最广、危害程度最大的一种，被称为海洋环境的超级杀手。我国也面临着海上重大石油污染问题，国家海洋局公布的2012年海上环境灾害和突发事件中，蓬莱19-3油田等溢油事故造成事故海域海水中石油类含量超第三类海水水质标准。事故海域浮游生物群落受到溢油影响，多样性指数低于背景值，严重破坏了海洋生态系统。污染物的危害主要体现为对生物体的毒害作用，因此，利用生物体毒性伤害状况监测其所处环境，可对污染总体效应进行直观、综合的评价[1]。石油水溶性成分(water-soluble fraction，WSF)进入生物体内后会发生生物转化，一些成分被氧化代谢后形成各种中间代谢物，这些中间代谢物具有很高的生物活性，容易对生物体产生毒性。WSF对鱼类的危害的最敏感阶段主要是早期发育阶段，如鱼精子的活性、精卵的受精率、受精卵的孵化率、仔鱼的存活率及仔鱼生长发育过程等，具体表现为：抑制、畸变、致死等效应[2]。相关研究表明暴露于多环芳烃等石油成分中会影响幼鱼发育，从而导致幼鱼死亡率急速上升[3]。

热休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)，是生物体在受到外界环境胁迫因子(如高温、低温、缺氧、病原入侵、污染和饥饿等)刺激下所产生的一类对细胞起保护和修复作用的特殊蛋白[4]。HSPs普遍存在于自然界原核、真核细胞中，分为4个家族——HSP90家族(分子量为83～90 kDa)、HSP70家族(分子量为66～78 kDa)、HSP60家族以及小分子量HSPs家族(12～43 kDa)。HSC70是HSP70家族中组成型的基因，主要参与蛋白质的折叠、解折叠和组配[5]，并且能被外界刺激所诱导[6]。一些研究表明，HSC70对不同污染物有着广泛反应性[7-11]。暴露在农药毒死蜱40 d后，鲤鱼(CyprinuscarpioL.)肝脏等器官内HSC70表达量显著上升[12]；重金属铜和镉则明显抑制中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)HSC70基因表达[13]；在24 h急性暴露后，摇蚊(Chironomustentans)幼虫HSC70基因被壬基苯酚显著诱导[14]。但石油污染对海洋鱼类HSC70的影响鲜见报道。

褐菖鲉(Sebastiscusmarmoratus)分布于北太平洋西部，我国产于南海、东海、黄海和渤海，为暖温性底层鱼类。褐菖鲉对污染物相应敏感，适合于作为石油类污染及其生化效应尤其是低剂量效应的监测生物[15]。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是Notomi等[16]建立的一种新颖的核酸扩增技术，具有高特异性、高效率、便捷等特点，在等温条件下即可高效快速地完成扩增反应，可用于现场的快速检测。自2000年开发以来，LAMP技术已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的定性检测及动物胚胎性别的鉴定[17-19]。本文在国内首次将LAMP技术引入海洋环境监测领域，以褐菖鲉为实验动物，建立LAMP技术检测海洋鱼类HSC70基因的方法，并利用该技术检测不同浓度WSF暴露后褐菖鲉肝HSC70的表达量，从而为探究HSC70基因的生物功能及作为生物标志物应用于海洋石油污染监测的可行性提供科学依据。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

主要仪器：净化工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化设备工程有限公司)，荧光定量PCR仪(Mx3000p，吉泰生物科技有限公司)，恒温金属浴(CHB-A4-9602，杭州博日科技有限公司)，NanoDrop2000 Spectrophotometer(Thermo Fisher公司)，LA-320C实时浊度仪(北京蓝谱生物科技有限公司)，PCR仪(Bioer Serves Life公司)，5415R型冷冻离心机(Eppendorf公司)。

主要试剂：Bst DNA聚合酶(NEB公司)，琼脂糖(西班牙Biowest公司)，MgCl2(Sigma公司)，betaine(Bio Basic公司)，T4 DNA 连接酶 (Fermentas公司)，SYBR Green qPCR Mix (厦门鹭隆生物科技有限公司)，dNTP和DS2000 DNA Marker (东盛生物公司)，Tris和EDTA (上海生物工程公司)，原油 (AM，中油，购自阿根廷)，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 实验动物

褐菖鲉购自厦门市第八市场，体长(11.7±1.2) cm，体重(24.79±5.8) g，雌雄不拘。先在清洁沙滤海水中暂养7 d，选取活力好的个体进行污染实验。实验过程中如有个体死亡，减少缸内水量确保每只个体占据水体积2 L。

1.3 实验方法

1.3.1 石油水溶性成分污染实验

WSF的制备：含油海水储备母液的制备：将原油(中油，阿根廷)与清洁沙滤海水按体积比1:10 混合，电动低速搅拌机连续搅拌4 h，静置16 h后通过虹吸法分离出下层水溶相作为储备母液，置于4 ℃冰箱避光保存，使用前测定其油浓度。水溶相中油浓度的测定采用荧光分光光度法，以国家海洋环境监测中心20-3 油为标准，荧光测定波长Ex = 310 nm，Em = 365 nm。开始实验时，根据需要用清洁沙滤海水把原油WSF母液稀释到相应浓度及相应体积。

验证实验：实验设对照组和20、60、180 μg·L-13个不同的浓度组。每组10 条鱼，每组设两个平行，对照组50 L沙滤海水不含原油WSF。用充气机连续充气，喂以人工饵料，每天采用静态半置换法更新相应浓度的含油海水溶液50%。饲养期间水温17～19 ℃，盐度22～24‰。暴露后的第1 d取肝脏，置于-80 ℃冰箱保存待用。

剂量—效应实验：实验设对照组和25，50，75，100，125，150，175 μg·L-17个不同的浓度组。每浓度组10 条鱼，每组设两个平行，对照组50 L沙滤海水不含原油WSF。其余同验证实验。

1.3.2 褐菖鲉HSC70基因的克隆

1.3.2.1 简并引物的设计：利用NCBI检索亲缘关系相近物种相应的mRNA系列，用DNAMAN和Primer Premier 5.0软件设计引物。具体引物序列如表1所示。

表1 HSC70基因的简并引物Table 1 Degenerate primers of HSC70 gene

1.3.2.2 RNA提取及反转录：RNA 提取参照TaKaRa公司提供的RNAiso Plus 说明书进行，得到的RNA加入适量DEPC水使其浓度均为1 000 ng·μL-1；反转录按照Thermo公司提供的ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明进行，产物cDNA稀释5倍，分装保存于-20 ℃冰箱待用。

1.3.2.3 从模板cDNA中扩增基因序列及T载体克隆

以反转录得到的cDNA为模板进行PCR反应，产物纯化后与T载体连接，转化到大肠杆菌中，克隆得到的片段送至上海英骏公司测序。测序结果经NCBI数据库比对后，确认为褐菖鲉相关基因的mRNA序列，上传至NCBI基因数据库。

1.3.3 实时荧光定量PCR及环介导等温扩增技术引物设计

根据已登录GenBank的褐菖鲉HSC70(基因序列号：JX255673) cDNA序列设计real-time PCR引物，利用在线引物设计软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计LAMP 特异引物：FIP、BIP、F3 和B3，对应的引物序列如表2 所示。

表2 荧光定量PCR和环介导等温扩增方法引物Table 2 Primers of real-time PCR and LAMP methods

1.3.4 环介导等温扩增定量方法

LAMP反应体系：总体积25 μL，经优化后体系内各试剂含量分别为：8 mmol·L-1Mg2+，0.4 mol·L-1Betaine，1.4 mmol·L-1dNTPs，2.4 μmol·L-1内引物，0.4 μmol·L-1外引物，8 U Bst DNA聚合酶，1×ThermoPol Reaction Buffer，2 μL模板DNA，5 μL dd H2O。反应温度64 ℃。反应过程可产生焦磷酸镁乳白色沉淀，其含量与DNA含量成正比，因此利用浊度仪进行定量检测。

LAMP标准曲线的测定：以F3和B3(表2)为引物进行PCR反应，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，即得到LAMP反应的DNA标准品，利用NanoDrop2000分光光度计测定其DNA浓度，根据公式计算拷贝数：

其中质量——DNA标准品的质量浓度，ng·μL-1；分子量——DNA标准品的平均分子量=碱基数×660道尔顿/碱基，g·mol-1；阿伏伽德罗常数，copies·mol-1。

10倍稀释标准品，配制25 μL体系标准系列。利用LA-320C 实时浊度仪测定。实时浊度仪每6 s自动测定一次浊度，以浊度达到0.1时作为阳性判定标准，记录反应所需时间。

1.3.5 实时荧光定量PCR方法

配制10 μL real-time PCR反应体系，以GAPDH为内参，在荧光定量PCR仪上设置反应程序：95 ℃热启动变性2 min，进行40个循环(95 ℃变性20 s，63 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，并在延伸阶段之后设置读值温度83 ℃读值20 s)，收集FAM/Sybr 荧光信号。

1.4 数据统计分析

LAMP检测结果采用Microsoft Excel和SPSS 17.0软件处理，real-time PCR的检测结果用Microsoft Excel、Rest 软件分析处理，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并用Origin 8.0软件绘图。所有结果均用6个平行样的平均值±标准误差表示，实验组与对照组间数据的比较采用单尾t检验分析显著性差异。p<0.05为显著差异；p<0.01 为极显著差异。

2 结果(Results)

2.1 HSC70的环介导等温扩增定量方法的建立

LAMP标准系列在扩增过程中，浊度值随着时间的增加而增大，由图1可以明显观察到标准系列浊度值到达阈值0.1所需的反应时间随着模板含量的增加而逐渐减少。曲线1～6分别表示含有模板浓度依次为 0、4.77×105、4.77×106、4.77×107、4.77×108、4.77×109copies·μL-1的标准系列扩增变化趋势。

图1 HSC70扩增曲线Fig. 1 Amplification curves of HSC70

以标准品拷贝数对数值为横坐标，浊度仪反应达到阈值所需时间为纵坐标，绘制LAMP标准曲线，如图2所示。

图2 环介导等温扩增定量方法反应标准曲线Fig. 2 Standard curve of quantitative LAMP method

2.2 环介导等温扩增定量方法的可行性

原油WSF暴露1 d后取褐菖鲉肝脏，用LAMP和real-time PCR技术同时测定肝HSC70 mRNA 的表达量，结果如图3和图4所示，LAMP检测结果与real-time PCR检测结果基本一致。由图3可知，原油WSF暴露1 d后，褐菖鲉肝脏中HSC70 mRNA 表达量有明显的上调趋势，其中20 μg·L-1浓度组为显著增加，为对照组的1.38倍，之后随着WSF浓度升高，HSC70 mRNA表达量下降，60 μg·L-1浓度组和180 μg·L-1浓度组则没有显著性增加，只是略高于对照组。

图3 WSF暴露1 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表达量的变化(LAMP)Fig. 3 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 1 day (LAMP) (n=6; *p<0.05)

图4 WSF暴露1 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表达量的变化(real-time PCR)Fig. 4 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 1 day (real-time PCR) (n=6; * p<0.05)

2.3 石油WSF影响HSC70基因表达的剂量—效应关系

WSF暴露5 d后，利用LAMP定量测定HSC mRNA水平，结果如图5所示。褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表达量在50 μg·L-1组即有显著性增加，并在75 μg·L-1时达到最高值。而后HSC70 mRNA水平逐渐下降，除了100 μg·L-1浓度组仍表现为显著性诱导外，其他浓度组虽然较对照组有所诱导但没有显著性差异。

图5 WSF诱导5 d后褐菖鲉肝HSC70 mRNA 表达量的变化Fig. 5 The expression of HSC70 mRNA in the liver of S. marmoratus after exposure to WSF for 5 days (n=6; * p<0.05; ** p<0.01)

3 讨论(Discussion)

LAMP技术已经在病毒、寄生虫等定性检测方面得到广泛应用，但在定量方面的应用研究报道不多。有研究表明，LAMP技术已经应用于人类星状病毒和某些微生物的定量检测中[20-21]，但在毒理学方面的应用目前未见报道。在本研究中，褐菖鲉肝HSC70标准品拷贝数对数值与LAMP反应达到阈值所需时间表现出良好的线性相关性，相关系数达到0.9985，表明利用LAMP技术进行定量具有较高的精确性。同时利用LAMP技术和real-time PCR技术对WSF污染1 d后的褐菖鲉肝脏HSC70 mRNA的表达量进行定量检测，结果表明两种定量技术测定结果基本一致，说明LAMP技术可以应用于实际样品检测。与real-time PCR相比较，LAMP法具有无法比拟的简便快速、高度灵敏特异、成本低廉等优点，因此实际应用中更具优势。

热休克蛋白对污染物响应敏感，以往关于HSC70对重金属的响应研究开展较多[22-24]，近年逐渐关注有机污染物的影响，如烃类物质可以显著诱导生物体内HSPs mRNA 的表达[25]。在本研究中，褐菖鲉暴露于50 μg·L-1WSF 5 d后，HSC70基因就被显著诱导，在75 μg·L-1下达到最大值，而后随WSF浓度增加逐渐下降至对照组水平。与之变化趋势类似的，以不同浓度的苯并(а)芘(0、5、50、500 μg·L-1)处理摇蚊幼虫，5 μg·L-1的苯并(а)芘即可显著诱导摇蚊幼虫体内HSC70 基因，随着浓度升高，HSC70 mRNA表达量下降，但仍被显著诱导[14]。此外，以不同浓度的敌百虫处理近江牡蛎，发现极低浓度的敌百虫(0.1 μg·L-1)仍然能够诱导鳃中HSC70 基因显著高表达，表明HSC70 对敌百虫的刺激反应非常灵敏[26]。这都说明HSC70基因对污染物反应比较敏感，而且可引起HSC70显著诱导的污染物浓度均较接近环境浓度，同时野外调查研究也发现，长期的海洋重金属污染仍然可以显著诱导HSC70蛋白[27]，因此HSC70有望作为生物标志物用于监测海洋环境污染[28]。

暴露在WSF环境下，褐菖鲉肝HSC70的诱导表达可以认为是生物体克服不良环境和防止中毒的一种适应性改变，而诱导量的下降则反映了生物体可能因污染的毒性作用而产生了中毒反应，导致生物体在高浓度暴露后调节能力下降[29-30]。虽然本研究中并未出现HSC70基因表达被抑制的效应，但可以看到较高浓度WSF污染下，HSC70表达量逐步下降至对照组水平。若进一步增加污染物浓度或延长暴露时间，就有可能抑制HSC70基因的表达。

综合以上分析，作为一种快速、新颖的核酸扩增生物技术，LAMP定量测定褐菖鲉肝HSC70基因结果可靠，在海洋石油污染监测中应用中具有可行性和优越性。褐菖鲉肝HSC70对石油WSF污染响应较为敏感，在短期暴露中低浓度下即被显著诱导，有望海洋石油污染早期预警分子。但这还需进一步研究加以确定。

致谢：感谢厦门大学生命科学学院王重刚教授及国家海洋局第三海洋研究所张玉生研究员等给予的大力支持和帮助。

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