马氏珠母贝hsp90基因的克隆及芘胁迫对其表达水平的影响

杜俊俏，廖承红，周海龙，刁晓平2,,*，陈好，李玉虎，王富强

1. 海南大学环境与植物保护学院，海口 570228 3. 海南大学海口市环境毒理学重点实验室，海口 570228 2. 海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海口 570228 4. 海南大学农学院，海口 570228

近年来,持久性有机污染物(persistent organic pollutants，POPs)对海洋环境的影响成为近海环境保护面临的重要问题之一，基于污染物的特性，生物监测成为海洋环境监测中必不可少的工具。随着研究的深入，分子研究水平更能灵敏的检测生物体对污染物的反应机制，因此，研究和建立敏感的分子生物标志物，显得十分必要。

多环芳烃作为一种持久性有机污染物广泛分布在环境介质中，其中有很多是已知的或是潜在的致癌物质。1979年美国环保署USEPA已将16种PAHs列入优先控制的有机污染物黑名单[1]。芘作为多环芳烃的一种典型4环物质，具有遗传毒性和致癌性[2]。基于近海PAHs的污染特点以及毒性效应特征，对PAHs的环境污染状况开展生物监测技术的研究体现出重要的意义。热休克蛋白(heat shock protein，HSPs)是一类保守的应激蛋白，已被广泛用作于生物标志物，以反应环境应激和毒性[3]。在热休克蛋白家族中，研究较为广的是hsp70和hsp90家族基因。HSP90在保护生物体中起着重要的作用，它能被一系列的压力因素所调控，如热或冷应激，高渗应激，饵料匮乏，低含氧量，多氯联苯(PCB)，砷和重金属等，并且能用来监测环境有毒物质和环境应激[4-9]。Li等[10]研究发现，脊尾白对虾(Exopalaemoncarinicauda)肝胰腺组织hsp90的表达量在pH和氨态氮的应激下发生不同的变化；Snyder等[11]研究发现在贻贝(Mytilusgalloprovincialis)和鲍鱼(Haliotisrufescens)组织中，hsp70、hsp60、hsp90基因对热刺激和降解石油的刺激都做出了不同的感应。刘娜[12]研究了苯并芘暴露对菲律宾蛤仔hsp90基因的影响，结果表明在染毒第10天，Hsp90基因的表达量显著诱导上升。

目前，从双壳贝类克隆得到的hsp90包括栉孔扇贝(C.farreri)、菲律宾蛤仔(V.philippinarum)、纹冠蚌(C.plicata)、太平洋牡蛎(C.gigas)等。而关于多环芳烃芘对热带海洋重要经济动物马氏珠母贝hsp90的表达影响研究鲜见报道。本研究采用RACE技术扩增马氏珠母贝hsp90基因cDNA全长，对不同组织中hsp90的表达进行半定量和定量分析，同时利用荧光定量PCR方法检测芘暴露对马氏珠母贝肝胰腺组织hsp90基因表达的影响，旨在进一步探讨hsp90作为分子生物标记物监测海洋环境多环芳烃污染状况的可能性，为建立海洋环境污染的生态效应监测提供参考依据。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 试剂与仪器

主要实验试剂芘纯度99%(Aladdin公司)；TRIzoL Reagent (invitrogen公司)；cDNA第一链合成试剂盒以及RACE试剂盒，荧光染料试剂盒等均购自大连Takara公司，其他等试剂购于海南天地科技有限公司；其余试剂均为市售分析纯药品。主要仪器为My Cycler thermal cycler(Bio-Rad，USA)，Nano drop2000超微量分光光度计(Thermo，USA)；ABI7500型荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。

1.2 实验材料

马氏珠母贝(Pinctadamartensii)购于海南省陵水市养殖场，贝龄1.5龄，壳高5.78±0.26 cm，暂养于曝气海水中，连续充气，水温25±1 ℃，pH 8.2，盐度30‰。活体取其鳃组织立即投入液氮中，并转入-80 ℃冰箱冷冻保存待测。

1.3 总RNA提取和cDNA合成

总RNA提取时，取50～100 mg保存于-80 ℃鳃组织于研钵上，按照TRIzoL试剂说明书操作提取总RNA，得到的总RNA沉淀用DEPC处理过的无RNase的水溶解分装保存于-80 ℃。RNA的完整性通过普通1%琼脂糖电泳，EB染色，观察。RNA的浓度OD值采用超微量分光光度计检测，取A260/280=1.8～2.0的样品进行后续实验。取1 μg总RNA，按照反转录试剂盒(Thermo)的要求反转，反转产物cDNA于-20 ℃保存。

1.4 hsp90基因部分片段的克隆

根据NCBI Genbank数据库中已知的纹冠蚌(C.plicata)(HQ180224.1)、菲律宾蛤仔(V.philippinarum)(HM581640.1)、太平洋牡蛎(C.gigas)(EF687776.1)、栉孔扇贝(C.farreri) (AY362761.1)等近缘物种序列，使用Primer Premier 5.0和Oligo 7.0，Mega 5.0等软件设计简并PCR引物(见表1)。在0.2 mL EP管中加入10×Taq buffer 5 μL，2.5 mM dNTP 4 μL，hsp90-F/hsp90-R(10 μM)各2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，cDNA模板2 μL，加双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；采用Touchdown PCR，5个循环：94 ℃ 30 s，62～54 ℃ 30 s(每个循环降2 ℃)，72 ℃ 45 s；29个循环：94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s；72 ℃ 10 min。

PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶上电泳30 min，经凝胶成像系统确定目的片段后，切下目的条带称重，按照Agarose Gel DNA purification Kit 说明书纯化 PCR 产物。将纯化后的DNA片段与pMD18-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH5α表达，进行蓝白斑筛选，并进行菌液PCR验证转化成功，将成功转化的菌液送去上海生工测序。

1.5 hsp90cDNA末端快速扩增反应(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)

为了得到hsp90cDNA全长，根据1.4所得基因片段序列分别设计5’和3’RACE特异性引物。

5’RACE：cDNA采用SMARTer II A primer and 5’CDS primer进行反转，将反转录产物进行100倍稀释后取2 μL作为模板进行PCR反应，50 μL反应体系中加入1 μL 3’特异性引物hsp90_GSP1(10 μM)与1 μL 5’接头引物ΜPA primer，反应条件95 ℃预变性1 min，95 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循环，72 ℃ 0 min。所得到的的PCR产物进行稀释，取2 μL模板作为巢式PCR反应模板，取1 μL 3’特异性巢式引物hsp90_NGSP1(10 μmol·L-1)与5 μL通用引物NΜP(10×)进行巢式PCR，反应条件95 ℃预变性3 min，95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，25循环，72 ℃ 10 min。

3’RACE：cDNA采用3’CDS primer A进行反转录，所得到的的反转录产物经100倍稀释后取2 μL作为模板进行PCR反应，以5’特异性引物hsp90_GSP2、hsp90_NGSP2分别搭配3’末端通用接头引物ΜPA primer、NΜP进行PCR反应，反应条件与5’RACE相同。

1.6 hsp90cDNA序列分析和拼接

将所得到的的PCR产物分别进行割胶回收，连接转化等方法同上。将菌液送上海生工进行测序，应用NCBI Blast在线程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行比对确认。将序列进行拼接比对，并对所得到的序列以及所对应的蛋白序列的保守区域进行分析。

1.7 hsp90在不同组织中的表达

采集肝胰腺、鳃、外套膜以及闭壳肌、性腺、腹足等组织，分别提取总RNA，采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR检测hsp90在不同组织中的表达量的情况。

1.8 染毒实验设计

以自然海区所测芘的含量以及预实验的处理为参照依据，设置染毒浓度组。用一定量丙酮(助溶剂)溶解芘，配成一定浓度的储备液，设置5个芘处理组(0、4、8、16、32 μg·L-1)进行毒性实验，以0浓度为对照组，所有实验处理组均设3个平行。实验在50 cm×40 cm×30 cm的塑料水槽中进行，每只水槽20 L水，放18只大小均匀的马氏珠母贝，实验期间连续通气，不投饵料，每天换水100%并保证实验浓度前后一致。实验开始后分别于染毒1 d、5 d、7 d取样。取样时，每个平行组随机取贝3只，取其肝胰腺组织，立即投入液氮中，之后转移到-80 ℃冰箱冷冻保存待测。

1.9 芘对马氏珠母贝肝胰腺hsp90基因表达水平影响的定量检测

各个浓度与时间的肝胰腺组织样，RNA提取方式与1.4相同，反转录严格参照One Step SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit说明书进行，产物于-20 ℃保存待测。用于荧光定量PCR的引物如表1。Qhsp90根据已获得的cDNA片段(Genbank登录号KJ010545)设计荧光定量引物目的片段大小149 bp，内参引物gapdh根据已知序列设计(Genbank登录号AB205404.1)，目的片段大小134 bp。荧光定量PCR反应体系：2×SYBR green 12.5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ROX dye II 0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O补足至25 μL。反应条件：94 ℃ 15 s，40个循环：94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；溶解曲线条件：94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，94 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s。

1.10 数据分析

荧光定量PCR所得的数据应用Delta-Delta Ct方法[13]进行相对定量分析，基因的相对表达水平所得实验数据应用Excel和SPSS19.0软件进行统计分析。每个实验样本重复3次，取平均值。

2 结果(Results)

2.1 马氏珠母贝hsp90基因cDNA克隆与序列比对分析

利用简并引物，从马氏珠母贝鳃组织中扩得了cDNA为743 bp大小的hsp90目的基因部分片段。通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)从马氏珠母贝鳃组织中成功克隆了总长度为2 584 bp的hsp90 cDNA全长序列。其中5’末端非编码区(untranslation region, UTR)为75 bp，开放阅读框(open reading frame, ORF)包含2 178 bp，编码725 aa，分子质量为83.76 KDa，3’末端非编码区(Untranslation region, UTR)为332 bp。通过在线BLAST比对结果说明，由马氏珠母贝hsp90基因cDNA序列推导得到的氨基酸序列与其他亲缘物种具有高度同源性，且具有5个hsp90家族保守区域以及C端共有氨基酸序列MEEVD(如图1阴影部分)，由此确认所得序列为马氏珠母贝hsp90基因的cDNA全长。

应用ClustalW以及MEGA5.0软件将马氏珠母贝(Pinctadamartensii)HSP90氨基酸序列与GenBank中其他多种生物的HSP90氨基酸序列进行比对并利用DNAMAN软件绘制进化树(如图2)。马氏珠母贝HSP90与不同物种的进化树分析显示，HSP90与双壳类(栉孔扇贝AAR11781.1、菲律宾蛤仔ADK11101.1、海湾扇贝ABS50431.1、太平洋牡蛎ABS18268.1和近江牡蛎ADL59936.1)汇聚为一个分支，而其它物种如家鼠(NP_034610.1)、斑马鱼(AAC21566.1)、虹鳟鱼(NP_001118063.1)和中华蟾蜍(ABD75383.1)等则聚为另一分支。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

图1 马氏珠母贝hsp90基因cDNA全长及氨基酸序列注：阴影部分为热休克蛋白90家族的特征序列；起始密码和终止密码子用下划线指出Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of hsp90 from Pinctada martensiiNote: Heat shock protein 90 family signature motifs were highlighted as shaded regions; the start codon and stop codon were underlined.

图2 不同物种HSP90进化树分析(Bootstrap值为1 000，每个分支数值为Bootstrap分析所得百分比)进化树中的不同物种HSP90s: C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).Fig. 2 Neighbor-joining phylogenetic tree of protein sequences from Pinctada martensii and other selected species( Aligned sequences were bootstrapped 1 000 times and the numbers at the forks indicate the bootstrap proportions) ：C.farreri (AAR11781.1), R.philippinarum (ADK11101.1), A.irradians (ABS50431.1), C.gigas (ABS18268.1), C.hongkongensis (ADL59936.1), C.toreuma (AGH32328.1), C.plicata (ADN87332.1), P.undulate (AFZ93093.1), H.asinine (ABR15463.1), T.japonicas (ACA03524.1), M.musculus (NP_034610.1), D.rerio (AAC21566.1), O.mykiss (NP_001118063.1), B.gargarizans (ABD75383.1), G.gallus (CAA49704.1), C.mydas (EMP24483.1), R. sp. ( AAB23369.1), H.sapiens (AAA36026.1), B.dorsalis (AEJ88466.1).

2.2 马氏珠母贝中hsp90基因组织特异性分析

采用半定量和荧光定量PCR检测hsp90基因在马氏珠母贝外套膜(mantle)、鳃(gill)、肝胰腺(hepatopancreas)、闭壳肌(adductor muscle)、性腺(gonad)以及腹足(pleopod)中的表达情况。如图3所示，hsp90基因在不同组织中的表达顺序为：性腺>鳃>肝胰腺>外套膜>腹足>闭壳肌。

2.3 芘暴露对hsp90基因表达水平的影响

本研究用芘对马氏珠母贝进行暴露处理实验，设置5个不同的处理浓度组(0、4、8、16、32 μg·L-1)，利用荧光定量PCR技术对芘处理后第1天、5天、7天马氏珠母贝肝胰腺组织hsp90基因表达水平进行分析。图4-A结果表明，在肝胰腺组织中，染毒后第1 天，低浓度组与对照组相比无明显差异，但较高浓度组(16、32 μg·L-1)hsp90基因的表达量相比对照组显著上调(p<0.05)。染毒后第5天，与相同时间对照组比较，诱导现象明显，高浓度组32 μg·L-1表达量显著上调(p<0.05)；随着时间的延长，染毒后第7天，各浓度组hsp90基因表达量逐渐恢复到正常水平。从图4-B中发现，在芘处理后第1天和第5天，hsp90基因的相对表达水平随着浓度的升高表现出明显的剂量-效应关系。

图3 hsp90基因在不同组织中半定量和荧光定量PCR的结果(M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)Fig. 3 hsp90 expression level in different tissues by RT-PCR and real-time PCR (M: mantle；G: gill；H: hepatopancreas；AM: adductor muscle; P: plepod)

图4 马氏珠母贝肝胰腺hsp90基因相对表达水平随芘暴露处理时间变化情况(A)和马氏珠母贝肝胰腺hsp90基因相对表达水平随芘暴露处理浓度变化情况(B) (*：与对照组比较，p<0.05)Fig. 4 Changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with Pyrene treatment time (A) and changes of Pinctada martensii hsp90 gene relative expression level with pyrene treatment concentration (B) in hepatopancreas (*: compared with the control group, p<0.05)

3 讨论(Discussion)

热休克蛋白(HSPs)是普遍存在的且高度保守的应激蛋白，出现在从细菌到人类的所有生物中。当生物体处于潜在的有害条件时，它们扮演着重要的角色[14-16]。本研究通过RACE技术扩增得到的hsp90基因，其编码的氨基酸序列与其他近缘物种Blast比对结果可判定扩增所得到的cDNA序列属于hsp90基因家族，根据它的C-末端MEEVD序列的存在[17]，推定HSP90属于胞质HSP90家族。马氏珠母贝HSP90与其他双壳贝类(如香港巨牡蛎、栉孔扇贝)、鱼类(斑马鱼、虹鳟鱼)等物种具有很高的相似性，其中与香港巨牡蛎(Crassostreahongkongensis)相似性为89%，与栉孔扇贝(Azμmapectenfarreri)相似性为85%，与小家鼠(Musmusculus)相似度80%，与斑马鱼(Daniorerio)相似性79%。

HSP90在细胞中表达丰度很高，甚至在无应激条件下，在多数组织中也占有1%～2%的细胞蛋白总量[18]。它具有多种生物功能，如维持细胞结构完整性、维持类固醇类受体和转录因子、纠正蛋白质的错误折叠以及参与细胞周期调节、细胞信号传导、机体免疫调节等重要的生理功能[19-22]。本研究中通过半定量RT-PCR和荧光定量PCR方法检测了hsp90基因在不同组织中的表达，与其他五种组织相比，在性腺中的表达量是最高的，这与其他研究者的研究结果相类似[23-24]，这可能意味着hsp90基因与生殖器的生长成熟有关。

HSP90与HSP70一样具有分子伴侣的看家功能，参与细胞调节蛋白的折叠与装配过程[25]。HSP90s是细胞中最重要的一种多功能应激蛋白且被广泛研究。在正常的细胞生理活动，如细胞分裂，分化，发育中都能检测到HSP90的表达。在应激条件下hsp90的表达受到显著刺激，表明它们的主要功能之一是保护细胞免受损伤[26-27]。本文通过典型多环芳烃芘对马氏珠母贝采取染毒胁迫实验，采用荧光定量PCR手段检测不同浓度不同时间下hsp90基因在马氏珠母贝肝胰腺组织中的变化情况。

肝胰腺作为双壳类软体动物的解毒代谢器官，也是外源物质进入机体后进行生物转化的主要场所。本研究发现在肝胰腺组织中，hsp90基因对芘胁迫所表现出的基因相对表达水平，主要表现出随时间的延长先增加后下降的趋势。在胁迫条件下，hsp90基因的表达上调是对胁迫影响机体所造成的变性蛋白质增多做出的响应机理[28]。在暴露后第1天和第5天，高浓度组hsp90表达水平与对照组相比表现出显著的上调现象(p<0.05)，这与张俊鸿等研究发现焦炉工高剂量组淋巴水平hsp90水平高于对照组和低剂量组相似[29]。高浓度组引起hsp90显著上调可能是诱导了细胞色素P450相关系统产生解毒代谢过程，发生氧化应激，致使细胞体内产生过量的氧化自由基ROS，进而诱导hsps基因家族的表达[30]。在本研究中随着芘暴露时间的延长，hsp90基因表达量逐渐恢复到正常水平，这可能是由于机体逐渐适应环境，体内基本已恢复平衡。芘暴露下hsp90基因上调是生物体自我保护的一种反应机制，研究发现hsp90基因的上调与芘浓度呈现出一定的正相关，这一剂量-效应关系与郑森林等报道的苯并芘诱导蚯蚓hsp90基因的上调相似[28]。

本文通过设计近缘物种的简并引物以及RACE手段扩增得到了马氏珠母贝hsp90基因cDNA全长序列。采用荧光定量PCR检测发现芘胁迫对马氏珠母贝hsp90基因的转录具有一定的上调作用，热休克蛋白在环境外源物刺激的情况下所作出的反应是保护机体免受芘胁迫污染的自我保护应答。在芘胁迫马氏珠母贝中，hsp90基因在肝胰腺中表现出一定的剂量-效应关系， 因此，hsp90基因可作为环境应激与毒性的一种理想的生物标志物。

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