梁 群 刁冰冰 王 丛 (黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨 150040)
脓毒症(Sepsis)是机体在受感染后或在休克、创伤等应激状态下自身免疫系统被过度激活致使大量炎性介质失控性释放,继而引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)[1],因其常并发脓毒症休克及多器官功能衰竭,成为各地医院重症监护病房患者死亡的主要原因之一。目前对预测脓毒症的发展方向和预后评估上临床仍缺乏有效的手段,因此积极探索脓毒症炎症介质和抗炎介质浓度的变化,将为浓毒症患者的疾病发展方向和预后评估提供新策略。在参与脓毒症炎症反应的炎症介质中,最为典型的炎症介质为白细胞介素(IL-6),而且是导致脓毒症患者组织损伤的重要因素。目前医学界公认的炎症抑制细胞因子则是白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10),它主要由Th2 细胞产生,因其具有良好的抗炎和免疫抑制特性而成为目前脓毒症相关研究的主要炎症因子[2]。本研究主要是观察化纤胶囊(益气养阴活血)对脓毒血症模型大鼠血清TNF-α、IL6 与IL10 的影响从而对临床上脓毒血症患者的治疗和相关炎症介质的变化给予提供帮助。
1.1 动物 雄性和雌性Wistar 大鼠各45 只,体质量为(150±20)g,提供单位为黑龙江省中医药大学实验动物研究中心,饲养环境清洁,自然光线采光,温度(21±4)℃,相对湿度54%~76%,采用普通专用配比的饲料预养5 d 后进行实验研究。
1.1.1 药物化纤胶囊(10g/粒) 由黑龙江省中医药大学附属一院制剂室制备,成分包含党参、黄芪、丹参、当归、太子参、沙参、麦门冬、蛤蚧等16 味中药。血必净注射液:每支10 ml,天津红日药业股份有限公司生产,批号:国药准字Z20110233。
1.1.2 血液标本采集 运用常规方法,存于抗凝试管中,充分摇匀,3 000 r/min,常温离心15 min,后存放于-80℃冰箱内保存标本。实验前将标本复苏于常温下,采用同一批号试剂进行测定,血清TNF-α、IL-10 和IL-6 浓度用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定(TNF-α、IL-10 和IL-6 试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供,美国A&D 公司生产),实验步骤按标准流程操作。
1.2 造模及实验方法
1.2.1 实验用动物模型制备 采取禁食24 h 后以10%水合氯醛(0.4 ml/100 g)进行腹腔注射麻醉。将大鼠四肢及牙齿捆绑以固定动物模型,取仰卧位于操作台,用5%碘伏溶液以消毒动物模型,用75%酒精溶液给动物模型以脱碘。沿腹正中线切开腹部皮肤约2 cm,用1 号线采取盲肠结扎术(距盲端1~2 cm 处)结扎,在结扎处远端采用18 号穿刺针穿刺盲肠2 至3 次,最后将盲肠纳入腹腔后封闭腹腔,术后2 d 大鼠脓毒血症模型造模完成。
1.2.2 实验分组及给药方法 将90 只大鼠随机分成空白组(n=9)、脓毒症组(模型组,n=9)、血必净组(对照组,n=36)及化纤胶囊组(治疗组,n=36),血必净组(对照组)和化纤胶囊组(治疗组)又分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ6 个亚组,每组6 只。Ⅰ组实验模型观测CLP 术后7 d 的存活率,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ5 个亚组分别为CLP 术后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h组。空白组不造模,其余3 组均造模。造模2 d 后治疗组给予化纤胶囊,1 次/d 口服;血必净组(对照组)予血必净1 次/d 静脉注射;空白组与脓毒症组(模型组)均灌等量生理盐水,连续给药7 d 直至检查前24 h 停药。
1.2.3 实验标本的采集及检测 在各规定的时间点上,直接在大鼠心脏处取4 ml 血并在血里加入乙二胺四乙酸,在4℃下的环境中用抗凝管以3 000 r/min 离心15 min 后,在-80℃冰箱内保存上清液。采用ELISA-α 法检测血清中TNF-α、IL-10 和IL-6的水平,操作流程按照试剂盒所附说明书步骤进行。
1.3 统计学处理 应用SPSS18 统计软件,计量资料以±s 表示,采用方差分析及χ2检验。
2.1 各组大鼠7 d 生存率的比较 脓毒血症组与化纤胶囊组的7 d 生存率分别为0 和83.33%。化纤胶囊组生存率明显高于脓毒血症组存活率,两组比较差异明显(P<0.05),证明具有统计学意义。
2.2 各组实验模型的血浆TNF-α 水平比较 如表1 所示,脓毒症组大鼠血清TNF-α 浓度快速升高,脓毒症组大鼠6 h、12 h、24 h 血清TNF-α 浓度变化较空白组比较显著升高,各时间点差异比较有统计学意义,经过治疗化纤胶囊组大鼠12 h、24 h 血清TNF-α 浓度较脓毒症组显著降低,差异比较显示有统计学意义(表1),对照组和治疗组在治疗效果上无统计学差异。
2.3 脓毒血症组模型的血清IL-6 浓度动态变化 与空白组的浓度变化相比,脓毒血症组大鼠血清IL-6 浓度在发病6 h、12 h 及24 h 快速升高,各时间点差异比较有统计学意义,化纤胶囊组大鼠12 h、24 h 血清IL-6 浓度与脓毒血症组同时期浓度比较明显下降,差异有统计学意义(表2),对照组和治疗组在治疗效果上无统计学差异。
2.4 各组大鼠血浆IL-10 水平浓度动态变化 如表3 所示,脓毒血症组与空白组比较,血浆IL-10 水平下降(P<0.05);与脓毒血症组比较,血必净组IL-10 水平在CLP 后6 h 下降明显,12 h 到达峰值,各时间点(除2 h 时点外)与脓毒血症组比较,差异有统计学意义(P<0.01);与脓毒血症组比较,化纤胶囊组在6 h、12 h、24 h 及48 h 4 个时间点血浆水平IL-10 下降(P<0.01)。
表1 各组血清TNF-α 浓度变化比较(±s,ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s,ng/ml)
表1 各组血清TNF-α 浓度变化比较(±s,ng/ml)Tab.1 Comparison of serum TNF-α concentrations in each group(±s,ng/ml)
Note:Model group compared with blank group,1)P<0.05;the treatment group compared with model group,2)P<0.05.
表2 各组血清IL-6 浓度变化比较(±s,pg/ml)Tab.2 Comparison of serum IL-6 concentrations in each group(±s,pg/ml)
Note:Model group compared with blank group,1)P<0.05;the treatment group compared with model group,2)P<0.05.
表3 各组模型血清IL-10 水平变化比较(±s,ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s,ng/L)
表3 各组模型血清IL-10 水平变化比较(±s,ng/L)Tab.3 Comparison of serum IL-10 concentrations in each group(±s,ng/L)
Note:Model group compared with the control group,1)P<0.01;the treatment group compared with model group,2)P<0.01.
本实验选用盲肠穿刺结扎法(CLP)制备Wistar大鼠脓毒症模型是因CLP 模型更接近临床急性肠穿孔和腹膜炎的病发过程,能较真实地反映脓毒症的病理生理变化使研究更具说服力,在脓毒症过程的早期身体释放炎症因子,典型的如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6 等,机体以激活白细胞及凝血系统来阻止病原微生物的进一步扩散,表现以促炎症反应为主。IL-10 等抗炎因子和可溶性TNF 受体,往往伴随促炎因子的生成而过度产生,并且有对抗炎症介质的作用,防止过度炎症反应的发生。炎症介质和抗炎介质是决定在脓毒血症过程中能否达到动态平衡的主要因素[3]。如果促炎反应占优势时,表现为免疫亢进或全身炎症反应综合征(SIRS),使机体对外来打击反应过于强烈,致使出现多脏器功能障碍综合征(Multipleorgan dysfunction syndrome,MODS);当抗炎反应占优势时,则体现为代偿性抗炎症反应综合征或免疫麻痹,使机体对外来打击反应下降,对感染更为易感并且加重脓毒症和MODS[3,4]。脓毒症更易引发SIRS[5]若SIRS 进一步发展将诱发脑部疾病、肾功能不全,心肺功能受损等其他相关疾病,甚至部分或大部分功用丧失[6-8],于是在炎症反应的初期控制其发展和恶化,防止SIRS 的发生,将有利于缩短病程而且对减缓病情又有非常重要的临床价值。目前医学界研究显示对炎性介质的治疗将为重症脓毒血症的治疗提供新的对策,临床资料显示脓毒血症患者存活率多少与炎性介质密切相关,经药物治疗的脓毒症血症患者血浆TNF-α、IL-6 水平下降则患者的存活率较高,反之,血浆TNF-α、IL-6 水平上升则患者的存活率较低。本研究表明,化纤胶囊(益气养阴活血)能显著降低脓毒血症大鼠血浆TNF-α、IL-6 的水平,对脓毒血症大鼠血浆IL-10 的水平下降不明显,尚需进一步结合大样本实验研究观察。
据现代医学研究显示脓毒症病因复杂,治疗困难,病死率高是目前医学界公认难以治愈的危重症疾病之一,因此做到早发现、早治疗脓毒症是改善患者预后的关键。要从根本上提高脓毒症患者生存率,则要从其发病机制的研究上寻找新的更有效的干预靶点[9,10]。中医药虽然对脓毒症的治疗有一定疗效和创新,却未能从分子生物学方面阐释其作用机制,因此应用中药治疗脓毒症并不能在国际上得到推广。本实验拟用“益气养阴活血法”从益气养阴和活血化瘀两方面同时入手,系统研究益气养阴活血方化纤胶囊对同时纠正免疫、炎症方面在分子水平上的作用机制,运用中药复方制剂早期多靶向治疗,阐明该中药防治脓毒血症的作用机理。本实验结果表明,化纤胶囊能降低脓毒症大鼠病死率,值得在临床工作中进一步推广研究。
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