不同方法提取和处理中华绒螯蟹组织蛋白的过敏原组分分析①

朱黎娜 侯丽英 张盈莹 周宇捷 李韶深 李会强 (天津医科大学医学检验学院，天津 300203)

食物过敏(Food allergy，FD)作为一类常见的过敏性疾病，近年来发病率逐渐升高，几乎5%的成人和8%的儿童有食物过敏的症状，已严重影响了人们的生活健康［1-3］。甲壳类食物作为常见的食物过敏原，是八类主要过敏性食物之一，而中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国人群最常食用的，也是极易引起过敏的特有的甲壳类动物之一。

目前，临床上检测血清特异性IgE(special IgE，sIgE)多采用国外系统和试剂盒，常使用提取的天然过敏原作为已知抗原;在食物过敏的基础研究中，也使用所提取的食物蛋白溶液作为食物过敏原鉴别的基础材料。但由于蛋白的提取方法、抗原的处理方式不同，蛋白提取溶液中的组分也存在差异。此种差异可影响临床实验室血清sIgE 检测结果的准确性，同时也会造成过敏原鉴别等基础研究结果的差异。此外，进口试剂盒提供的蟹蛋白溶液多为海蟹蛋白，与中华绒螯蟹蛋白存在一定差异［4］。因此，探讨如何制备组分完整、免疫活性良好的中华绒螯蟹组织蛋白溶液具有重要意义。本研究通过分析不同提取方法及加热处理前、后的中华绒螯蟹组织蛋白组分，并用蟹过敏患者血清中的sIgE 作为“探针”，通过Western blot 分析其过敏原免疫活性，以寻找最合适的中华绒螯蟹过敏原提取和处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 新鲜中华绒螯蟹购自天津市河西区三义庄菜市场。20 例蟹过敏患者的阳性血清(自天津市中医药研究院附属医院)，患者病史主诉为中华绒螯蟹过敏，血清总IgE＞100 kU/L，蟹sIgE＞0.35 kU/L 等。所有阳性血清均经提取的河蟹蛋白混合溶液作为包被抗原采用斑点印迹方法进行确认。阴性对照血清:1 份。采集无任何过敏史的健康体检人群血清作阴性血清。分离血清并分装保存于-20℃。

1.1.2 仪器与试剂 垂直板型电泳槽、半干式转膜仪、凝胶成像系统、PROTEAN i12 IEF 仪、水化盘、聚焦盘(美国Bio-Rad 公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Millipore 公司);微量电动组织匀浆器(美国Kimble 公司)。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、过硫酸铵(AP)、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、β-巯基乙醇、Tween-20、Tris、溴酚蓝、甘油、碘乙酰胺、碱性磷酸酶(ALP)显色底物、碘乙酰胺、ALP 标记的鼠抗人IgE 等均购自美国Sigma公司;3-［(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸(CHAPS)、硫脲购自美国Amresco 公司;IPG 预制胶条7cm pH3-10、两性载体Pharmalyte pH3～10、尿素、矿物油购自美国GE 公司;二硫苏糖醇(DTT)，购自美国Merck 公司;蛋白酶抑制剂complete EDTA-free，购自瑞士罗氏公司;蛋白分子量标准SM1811，购自美国Fermentas 公司。

1.2 方法

1.2.1 制备蛋白粗提液 方法A:PBS 提取法。参考文献［5］，取蟹肉组织用研钵在液氮环境中研磨成匀浆，按每克样品加入0.01 mol/L PBS(pH7.2)15 ml，再用电动匀浆器匀浆30 s，置4℃冰箱，期间搅拌大约1.5 h，24 h 后，10 000 r/min，4℃离心60 min，收集上清，过滤后分装-80℃保存，备用。

方法B:丙酮抽提法。参照文献［6］，将蟹肉组织在液氮环境中按体积比1∶15 的比例加入预冷丙酮研磨均匀，再用电动匀浆器匀浆30 s，置4℃冰箱脱脂24 h 至脱脂完全为止，待丙酮完全挥发后，按每克样品加入0.01 mol/L PBS(pH7.2)15 ml，置4℃冰箱，期间搅拌大约1.5 h，24 h 后，10 000 r/min，4℃离心60 min，收集上清，过滤后分装-80℃保存，备用。

方法C:裂解液提取法。分为熟蟹和生蟹，参考文献［7］，将蟹肉组织在液氮环境中将按体积比1∶4的比例加入裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4%CHAPS、40 mmol/L Tris、蛋白酶抑制剂、去离子水，使用前加入65 mmol/L DTT)研磨均匀，再用电动匀浆器匀浆30 s，置4℃冰箱静置1 h，10 000 r/min，4℃离心60 min，收集上清，过滤后分装-80℃保存，备用。

1.2.2 SDS-PAGE 和双向电泳分析蛋白组分 用不连续系统进行垂直板电泳，对蟹蛋白粗提液组分进行分析，浓缩胶为5%，分离胶为10%，待分析样品与上样缓冲液以适当比例混合(A、B 法1∶4，C 法1∶15)，煮沸5 min，每孔上样6 μl，65 V 电压堆积20 min，135 V 电压分离，待溴酚蓝指示到达底部，电泳完毕，考马斯亮蓝R250 染色1 h，脱色液充分洗脱，拍照。

双向电泳分析蛋白组分 第一向:等电聚焦电泳。分别将不同方法提取的蛋白样品与水化上样缓冲液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L Tris、0.001%溴酚蓝、去离子水，使用前加入65 mmol/L DTT、0.2%两性载体Pharmalyteph3-10)以适当比例(A、B 法1∶4，C 法1∶15)混合，水化液与样品溶液终体积为125 μl，用加样枪将混合样品均匀铺在胶条槽内，将7 cm 胶条胶面朝下覆盖在蛋白样品上，覆盖矿物油1 ml。电泳参数设定为18℃，50 V 水化14 h;S1:250 V 线性30 min;S2:500V 快速30 min;S3:4 000 V 线性3 h;S4:4 000 V 快速20 000 Vh;S5:500 V 快速 任意时间。第二向:SDS-PAGE 电泳。等电聚焦完成后将胶条取出，用新鲜配制的平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ(平衡母液中含0.375 mol/L pH8.8 Tris-HCl、6 mol/L 尿素、20%甘油、2%SDS，平衡液Ⅰ加入2%DTT，平衡液Ⅱ加入2.5%碘乙酰胺)，分别平衡10 min，放在干燥的滤纸上，备用。配制T=10%的聚丙烯酰胺凝胶，待胶凝固后，将胶条轻推入凝胶上方，再加入0.5%低熔点琼脂糖封胶液，凝固后，即可开始电泳。65 V 恒压15 min，135 V 恒压分离，待溴酚蓝指示到达底部，电泳完毕，考马斯亮蓝R250 染色1 h，脱色液充分洗脱，拍照。

1.2.3 Western blot 分析过敏原组分 将不同方法提取的蛋白粗提液进行SDS-PAGE 电泳后，干转膜仪15 V 电压下30 min，干转到PVDF 膜上，用5%脱脂奶封闭过夜;TBST 洗涤3 次，每次10 min;将已封闭的膜依次加入TBST 稀释20 倍的过敏患者血清(3 例阳性单例血清和10 例阳性混合血清)，室温摇床孵育2 h，再4℃过夜;洗3 次;加入酶标二抗(TBST 稀释1 000 倍)，室温摇床孵育2 h;洗3 次;加入AP 底物避光显色10 min;用水洗涤，观察结果，拍照。同时，将裂解液提取的加热前、后的蟹蛋白进行SDS-PAGE，并进行半干转，用10 例阳性血清和1 例阴性血清进行Western blot 试验，方法同上。

2 结果

2.1 不同提取和处理方法蟹蛋白组分分析

2.1.1 3 种提取方法蟹蛋白组分分析 3 种提取方法中华绒螯蟹蛋白提取液经SDS-PAGE 及考马斯亮蓝染色后结果见图1。3 种方法制备的蛋白溶液所含成分不相同，PBS 提取液显示出12 条可辨的蛋白条带，其中94、85、76、66、18 kD 条带染色较深，为主带;丙酮提取液有12 条可辨的蛋白条带，较清晰的为94、85、76、36 kD;裂解液提取液白有21 条可辨的蛋 白条带，较清晰的为200、125、51、43、38kD。采用双向电泳对上述3 种蛋白提取液进一步分析，结果如图2 所示。PBS 提取液在18～100 kD、pH4～9 的范围内存在斑点，其中70～100 kD、pH5 和18 kD、pH4处有两个斑点大且染色深，为主要蛋白。丙酮提取液在18～100 kD、pH4～10 的范围内存在斑点，其中70～100 kD、pH5，38 kD、pH4 和18 kD、pH4 处有三个主要斑点。裂解液提取液斑点多，分布广，在18～200 kD、pH3～10 的范围内有大量斑点，其中130 kD、pH5.5，100 kD、pH5，50 kD、pH4、40 kD、pH5，38 kD、pH8 和18 kD、pH4 处有6 个主要斑点。综合SDS-PAGE 电泳和双向电泳结果可以认为裂解液提取法所制备的蛋白提取液蛋白质组分较完整。

图1 中华绒螯蟹组织蛋白提取液SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

图2 中华绒螯蟹组织蛋白提取液双向电泳分析Fig.2 2-DE analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

图3 加热前、后(裂解液提取法)蛋白溶液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of extract of heating and without heating crab proteins

图4 中华绒螯蟹组织蛋白提取液Western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of extract from tissue protein of Eriocheir sinensis

2.1.2 加热前、后(裂解液提取法)蟹蛋白组分分析 裂解液提取的加热前、后的中华绒螯蟹蛋白提取液经SDS-PAGE 蛋白电泳后图谱如图3 所示，生蟹和熟蟹的蛋白基本相同，仅个别条带有区别:200、125、115、105、94、85、79、53、51、43、38、36、33、29、27、25、20、19、18、16、14 kD 为共同条带，生蟹在76 kD 处有条带，熟蟹在130、113、10 kD 处也有条带。

2.2 免疫活性鉴定 不同方法提取的蟹蛋白提取液经Western blot 分析，分别使用单例和混合的阳性血清作为探针，结果如图4 所示。以阳性血清为探针的印迹中，76、43、38、18 kD 为三种提取和处理方法的共同条带;PBS 提取的蟹蛋白阳性反应条带主要分布在76、66、53、43、38、18 kD;丙酮提取的蟹蛋白阳性反应条带主要分布在94、76、66、50、43、38、18 kD;裂解液提取的蟹蛋白阳性反应条带主要分布在200、105、94、76、43、38、18 kD，裂解液提取的加热前、后蟹蛋白提取液经Western blot 分析，分别使用10 例阳性和1 例阴性血清作为探针，结果如图5 所示。病人血清与生蟹和熟蟹蛋白反应条带基本一致，仅个别条带有区别。3 号和6 号病人在200 kD处生蟹蛋白出现条带，而熟蟹没有。某些条带不同病人有不同的反应性。阴性对照血清(N)无反应条带出现。

图5 加热前、后蟹蛋白提取液提取的蟹蛋白Western blot结果Fig.5 Western blot analysis of extract of heating and without heating crab proteins

3 讨论

中华绒螯蟹，又称河蟹、大闸蟹，是引起食物过敏的主要的甲壳类食物之一。研究显示，存在于甲壳类动物中的过敏原有原肌球蛋白、球蛋白轻链、精氨酸激酶、肌钙蛋白C 等［8-11］，不同种类的甲壳类动物过敏组分不同。此外，不同个体间对同一过敏食物的反应存在异质性，可能导致漏检。因此，为提高临床诊断中华绒螯蟹过敏原的灵敏度和特异度及脱敏治疗的效果，需要制备组分全、免疫活性好的过敏原溶液，开发适合我国人群的过敏性疾病诊断试剂。

本研究通过SDS-PAGE 比较分析了文献报道中常用的提取食物蛋白的PBS 提取法、丙酮抽提法和裂解液提取法3 种方法所制备的中华绒螯蟹蛋白溶液的蛋白组分及其分子量，发现裂解液提取法提取的蛋白组分多、全，分子量跨度大，不同提取方法不同分子量的蛋白浓度也不相同。虽然3 种蛋白提取液中94、85、76、43、36、30、18 kD 的蛋白都存在，但双向电泳的结果显示裂解液提取的蛋白溶液分子量和等电点分布都较其他两种方法广泛，所含蛋白组分较丰富。

以过敏患者的血清(特异性IgE)为“探针”，通过Western blot 可鉴别所提取蛋白溶液中蛋白质的免疫活性。76、50、43、38、18 kD 处的蛋白为三种提取液都含有的致敏蛋白，与吴兴达课题组的报道相似［12］。吴序栎等［13］用Western blot 鉴定分离的蛋白组分中的致敏成分，蟹全身蛋白有5 条明显的阳性条带，为25、23、21、19 和11 kD 处;毛露甜等［14］的研究发现中华绒螯蟹在66 kD 处有明显致敏条带，与本研究结果有差别，可能与蟹蛋白的提取方法不同及人群的地域性有关而在裂解液提取的蟹蛋白中有些特有的高分子量的蛋白可与阳性血清中的sIgE 结合，为致敏蛋白，此前未见报道;图4 中2 号病人对丙酮和PBS 提取的蛋白几乎没有反应性，但对裂解液提取的蟹蛋白有反应性，说明裂解液提取的蛋白有助于判断弱阳性病人。这些对发现新的中华绒螯蟹过敏原，完善临床诊断试剂盒，减少临床假阴性的产生有很大的帮助。

邵洁等［15］研究报道，血清sIgE 检测结合皮肤点刺实验(Skin prick tests，SPT)具有较高的食物过敏确诊率，但两者也存在不相符的情况，需用双盲安慰剂对照食物激发试验(Double-blind placebo-controlled food challenge，DBPCFC)进行确诊。这与试剂盒提供的蛋白原液有关。目前临床检测IgE 使用的进口试剂盒提供的是锯缘青蟹和梭子蟹等海蟹的天然过敏原作为蟹类过敏的检测组分。研究报道锯缘青蟹和梭子蟹的过敏组分主要集中在85、75、48、38kD 等处［14，16］，而对高分子量的蛋白的反应报道较少，而本研究提取的中华绒螯蟹蛋白提取液除了以上海蟹的主要反应区外，在105 甚至200kD 处也出现了反应条带，进一步研究可发现新的蟹类过敏原，同时，证实海蟹与中华绒螯蟹的过敏原的差异。

我国人群对蟹的食用方法除了煮熟还会进行腌制、生食，研究加热前、后的过敏原成分及抗原性可指导食品加工业生产丰富的无过敏或低过敏的蟹食品。本研究发现加热对蟹蛋白的影响较小，在高分子量区，熟蟹蛋白条带增多，可能与加热使某些蛋白结构改变、通过S-S 键聚合引起分子量增多相关，但对于原肌球蛋白等热稳定蛋白无影响。加热前后的蛋白抗原性基本相同，加热对蟹蛋白的致敏性没有改变。与文献中相关研究相符［17］，加热会引起牛乳中某些蛋白的结构改变、聚合，引起抗原性降低，如β-乳球蛋白，但对于热稳定蛋白酪蛋白的抗原性没有影响。但Abramovitch 等［18］通过ELISA、免疫印迹和嗜碱性粒细胞活化试验比较加热前后梭子蟹与sIgE 的反应性，发现加热后的蟹肉反应性更高。这提示我们需要进行更多的试验及大样本分析来验证加热前、后的过敏原致敏性。但食用生、熟蟹肉都会都导致过敏人群的反应，蟹过敏患者应避免食用蟹产品。

根据本研究结果，我们认为裂解液提取法更适合制备中华绒螯蟹蛋白溶液，所获蛋白组分较完整，分子量跨度大，免疫活性强，与sIgE 结合更强，更适合应用于临床诊断中华绒螯蟹过敏性疾病。加热前、后蟹肉蛋白组分差别不大，但需要进一步收集病例，用多种试验对加热前、后的蟹肉蛋白的致敏性进行研究分析。下一步可通过中华绒螯蟹和海蟹的过敏原组分比较，研究两者不同的过敏原组分，并进一步分析抗原表位，通过重组表达，人工制备出适合中国人群的、过敏原组分齐全的蟹标准化抗原，提高临床对蟹过敏人群的特异性诊断，构建人工嵌合过敏原进行脱敏治疗。

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