副猪嗜血杆菌河南分离株的分离鉴定及药敏试验

董永军，王丽荣，赵俊江

（1.河南科技学院动物科学学院，河南 新乡 453003；2.河南科技学院抗体工程重点实验室，河南 新乡 453003）

副猪嗜血杆菌(HPS) 是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD 依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后保育舍阶段发病，感染高峰通常见于保育期的4～6周，发病率一般在10%～15%，严重时病死率可达50%[1]。副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种以急性败血症、多发性浆膜炎和关节炎为特征的细菌性传染病。该病为继发性疾病，常在蓝耳病病毒、圆环病毒等病毒感染后激发带菌猪和慢性感染猪发病，成为本病的传染源，病原菌主要存在于猪的上呼吸道，通过猪之间的接触、空气飞沫及污染物而传播[2]。在集约化猪场中，当猪群遭受环境不良、转群、去势、免疫注射、饲养不当等应激因素影响， 或者猪群感染猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性疾病时， 副猪嗜血杆菌病伺机暴发， 造成严重的经济损失[3]。目前， 该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。

在特定的条件下引起猪的多发性浆膜炎和关节炎，主要临床症状为发热、食欲不振、厌食、反应迟钝、咳嗽、呼吸困难、疼痛(尖叫)、关节肿胀、跛行、颤抖、共济失调，可视黏膜发绀、侧卧、消瘦和被毛凌乱随之可能死亡。种猪急性感染后可能留下后遗症，即母猪流产，公猪慢性跛行[4]。特征性病理变化为胸腔、腹腔浆膜及肺部炎症，胸腔内有大量的淡红液体及纤维素性渗出物。肺表面覆盖有大量的纤维素性渗出物并与胸壁粘连，多数为间质性肺炎，部分有对称性肉变。各脏器有不同程度的出血、淤血和坏死。镜检渗出物中有大量纤维蛋白、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和单核细胞。实质细胞呈现不同程度的颗粒变性、水泡变性和坏死，实质和间质可见充血、出血、炎性细胞浸润、纤维性渗出和水肿液蓄积[5]。

近年来，副猪嗜血杆菌病在国内猪场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其发病率和死亡率日渐升高。为此，本实验对河南省内疑似病例进行病原分离培养，以对本病药物防控中药敏检测及其灭活菌苗研制奠定基础；本实验还采用病原学和生化鉴定诊断， 并进行药敏试验， 以期为该病的诊治提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集

对河南某猪场的15头疑似副猪嗜血杆菌感染的病仔猪进行病理剖检。无菌条件下抽取心血、心包液和腹水，并采集病变明显的肺、心、肾脏等病料进行病原学检查。

1.1.2 菌种与主要培养基

金黄色葡萄球菌，各种药敏试纸片（左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等）；烟酰胺嘌呤二核苷酸、美兰染色、革兰氏染色、HE染色试剂，普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、加NAD的巧克力琼脂平板和TSA培养基、TSB 液体培养基均自制。

1.1.3 生化鉴定微量发酵管及试剂

葡萄糖发酵管、蔗糖发酵管、甘露糖发酵管、木糖发酵管、棉籽糖发酵管、甘露醇发酵管、硫化氢微量发酵管，氧化酶、3%过氧化氢、硝酸盐培养基。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌操作条件下， 采集病猪的心血、心包液、腹水、肺、心、肾脏等病料，首先划线接种于含NAD的巧克力琼脂平板或TSA培养基上，37 ℃培养48 h，然后挑取单个菌落进一步纯化培养[6]。

1.2.2 染色镜检

将培养后的单个疑似菌落涂片， 进行美兰染色和革兰氏染色， 镜检，观察菌体形态及染色特性。

1.2.3 培养特性

取疑似副猪嗜血杆菌菌落分别接种于普通营养琼脂平板、麦康凯培养基、绵羊鲜血琼脂平板、含NAD巧克力琼脂平板和TSA培养基，37 ℃恒温培养48 h， 观察菌落的生长情况。

1.2.4 生化鉴定

糖类分解试验：取纯培养后的细菌分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管内，倒置于洁净的小烧杯内，置灭菌培养皿中。37 ℃培养24 h，观察并记录结果。结果判断：无变化，培养液仍为紫色，阴性反应；产酸，培养液为黄色及产酸又产气，培养液变黄，并有气泡，阳性反应。

硫化氢试验：取纯培养的细菌接种于硫化氢微量发酵管，置于37 ℃培养24 h 后观察，培养液黑色者为阳性，无色者为阴性[7]。

氧化酶试验：加2～3滴试剂于滤纸上，用牙签挑取1个菌落到纸上涂布， 观察菌落反应。阳性反应在5～10 s内由粉色到黑色，15 min后可出现假阳性反应。也可以将试剂滴在细菌的菌落上，菌落成玫瑰红然后到深紫色者为阳性。

触酶试验：可用接种环将菌落放于载玻片的中央，加1滴3%过氧化氢于菌落上，立即观察有无气泡出现；也可以直接将3%过氧化氢滴加到菌落上观察有无气泡出现。

硝酸盐还原试验：把纯菌接种到硝酸盐培养基中，在37 ℃培养18～24 h，再加试剂甲（对氨基苯磺酸0.8 g+5 mol/L醋酸100 mL）和乙（α-奈胺0.5g + 5mol/L醋酸100 mL）各3～5滴，在30 s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是真正的阴性试验。[8]

1.2.5 卫星现象观察

挑取经纯化培养的可疑菌落，于绵羊鲜血琼脂平板上水平画线，再挑取金黄色葡萄球菌垂直划线，37 ℃培养24～48 h， 观察是否有卫星生长现象。

1.2.6 动物试验

将纯化菌接种于TSB 液体培养基，18 h后经菌落计数，将培养液稀释成每毫升含2×105个菌，皮下注射0.2 mL稀释液于小白鼠。

1.2.7 药敏试验

将培养纯化的菌种均匀涂布于含NAD的巧克力培养基上，然后按常规纸片法，将各种药敏试纸片（左旋氧氟沙星、恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、乳酸环丙沙星、氟苯尼考、头孢噻呋钠、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸、替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾等）贴于平板上，37 ℃恒温培养18～24 h，观察抑菌圈大小。

判定标准： 抑菌圈直径大于15 mm 为高度敏感；抑菌圈直径在10～15 mm之间为中度敏感；抑菌圈直径小于10 mm为耐药[9]。

2 结果与分析

2.1 分离培养结果

分离到3株细菌，分别命名为HPS 1、HPS 2、HPS 3。

表1 药敏实验结果

2.2 染色镜检

革兰氏染色阴性，多呈短杆状，有的呈球杆状，出现急性败血症的病猪血涂片美兰染色可见大量细菌，符合副猪嗜血杆菌的菌落和细菌形态[10]。

2.3 培养特性观察

3株细菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基、鲜血培养基上均不生长，在含NAD巧克力培养基和TSA培养基上呈光滑、无色透明或灰白色半透明、露珠状、扁平的小菌落。

2.4 生化鉴定结果

3个菌株均发酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不发酵甘露醇和木糖，棉籽糖不稳定(HPS 1为阳性，其余为阴性)，硫化氢试验呈阴性，氧化酶试验呈阴性，触酶试验呈阳性，硝酸盐试验呈阳性。所分离细菌鉴定结果均符合副猪嗜血杆菌的生化特性[11]。

2.5 卫星现象观察

在金黄色葡萄球菌线两侧有针尖大小、圆形、边缘整齐的菌落生长，呈现出典型的“卫星现象”并且不出现溶血现象，证明此菌为依赖NAD生长的细菌。

2.6 动物试验结果

56 h后小白鼠出现毛松、呆滞等症状。68 h后小白鼠出现死亡。从死亡的小白鼠回收到原病原菌。

2.7 药敏试验结果

从表1可以看出，分离菌株对左旋氧氟沙星均高敏，对恩诺沙星、磺胺间甲氧嘧啶、氟苯尼考、头孢噻呋钠全部敏感，对替米考星、阿莫西林、盐酸林可霉素、氨苄西林、青霉素钾均不敏感或耐药，对乳酸环丙沙星、克林霉素、硫酸庆大霉素、氟哌酸等药物敏感性表现不一。

3 讨论

副猪嗜血杆菌曾被认为是一种随机入侵的次要病原，在与猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、胸膜肺炎放线杆菌、链球菌等协同作用时才引发临床症状[12]。目前在兽医临床上副猪嗜血杆菌病已经变成一种常见的、可独立发生的疾病。本试验在分离病原时，对发热期病猪采集耳缘静脉或前腔静脉的血液； 病猪死后，采集心血、心包液、胸水、腹水、纤维蛋白性渗出物、肺脏和肝脏等作为病料，在患猪剖杀或死亡后12 h以内进行病原分离，可提高副猪嗜血杆菌的分离率。

细菌培养通过直接利用磷酸化NAD提供V因子，解决了配制培养基的问题。所分离细菌菌落较大，呈圆形灰白而突起，为革兰氏染色阴性，短杆状或球杆状，细菌形态与报道的相一致，疑似菌株生化实验结果表明，不溶血，可发酵蔗糖、甘露糖和葡萄糖，但不发酵甘露醇和木糖，硫化氢试验阴性，氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，硝酸盐试验阳性，均符合副猪嗜血杆菌的培养特性。

从药敏试验结果可以看出，分离菌对氟喹诺酮类药物和头孢噻呋钠高度或中度敏感，有试验报道认为副猪嗜血杆菌对头孢唑啉高度敏感，对头孢哌酮、氟苯尼考敏感，而对复方新诺明、青霉素G等有耐药性。原因可能是由于氟喹诺酮味苦而对猪群不常采用；左旋氧氟沙星和头孢噻呋钠的平均抑菌圈直径分别为22.0 mm和13.3 mm，说明左旋氧氟沙星在被调查猪场应用较少，保持高度敏感，头孢噻呋钠已有应用，抗菌作用不理想；氨基糖苷类抗生素在临床上大量应用，通常以注射给药为主，所以呈现部分为中度敏感；普遍应用的青霉素、氨苄西林、阿莫西林和林可霉素等已不敏感。如果猪场经常使用某种抗生素，对母猪进行定期群体预防性混饲给药，其携带耐药基因的细菌会通过哺乳、与子代共同生活等而传递给下一代，使耐药性变得严重。也有学者进行中药药敏试验，结果表明金银花及其复方制剂对副猪嗜血杆菌抑制作用明显。因此在临床上，应避免盲目用药现象，特别是在进行群体治疗时，最好先进行药敏试验，针对性地选择高敏药物，在发病早期采用全群注射给药法，或者采用部分中药制剂进行辅助治疗，以便达到最佳治疗效果。

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在寄生菌，是很难控制与净化的一种呼吸道感染病原。在环境卫生不好的猪场或者有其他发病感染时通常容易诱发副猪嗜血杆菌病的暴发。要想控制住疫情的暴发，猪场应该积极采取各种综合防控措施：首先应该改善饲养管理，补充饲料的各种营养成分，同时加强其他疾病的防控，自身也应该做好疫苗注射，增强仔猪对副猪嗜血杆菌的免疫力；其次，制订一套严格的管理制度，对外来的人员或外地购进的仔猪应该进行严格的检疫后才可进入养殖场；第三，对于养殖场自身环境进行改良，注意杀菌灭菌，防止猪的感染。

总之，副猪嗜血杆菌病的防治，应采取“养防结合”，有实力的养殖场应做药敏试验，选择敏感药物以便快速经济地控制副猪嗜血杆菌病的发生。预防中加强饲养管理，以减少或消除其他呼吸道病原，如提前断奶，减少猪群流动，杜绝猪生产各阶段的混养状况等。

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