不同毒力结核杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞铁蛋白及铁转运蛋白表达的影响①

庄 睿 王 霞 张 锋 宝 音 章 乐 吴 芳 吴江东 张春军 张 辉 李文娟 梁 晨 樊 超张万江

（石河子大学医学院病理生理学教研室/石河子大学《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室，石河子 832002）

不同毒力结核杆菌对感染小鼠肺泡巨噬细胞铁蛋白及铁转运蛋白表达的影响①

庄 睿 王 霞 张 锋 宝 音 章 乐 吴 芳 吴江东 张春军 张 辉 李文娟 梁 晨 樊 超张万江

（石河子大学医学院病理生理学教研室/石河子大学《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室，石河子 832002）

目的:探讨不同毒力的结核杆菌分别感染小鼠肺泡巨噬细胞后铁蛋白（Fn）和铁转运蛋白（FPN）表达量及其时相性变化。方法:利用制备的结核杆菌国际标准强毒株H37Rv株（以下简称H37Rv株）和卡介苗菌株（以下简称BCG）菌悬液，分别经小鼠尾静脉注射，建立各组小鼠感染模型。各组小鼠感染模型建立成功后，分别于第1、3、5、7、9、11、13、15天，进行肺泡灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，获取各组小鼠肺泡巨噬细胞。应用ELISA方法检测各组感染组小鼠肺泡巨噬细胞中Fn和FPN的表达含量;应用Western blot技术检测上述时间点各组感染的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn的表达量。结果:用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达，结果显示:于模型建成后第7、9、11天，H37Rv株组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞内Fn表达量明显减低，并且于第7天时表达量最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内FNP的表达，结果显示:不同毒力的结核杆菌菌株感染小鼠肺泡巨噬细胞后，各感染组内小鼠肺泡巨噬细胞FPN随处理时间延长表达逐渐降低;于感染第5天开始下降明显，第7、9天最低。H37Rv株组和BCG组表达接近，于第5、7、9天明显低于正常对照组FPN的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:结核杆菌感染导致巨噬细胞内Fn与FPN的表达均降低，并且感染巨噬细胞Fn和FPN的表达与结核杆菌的毒力强弱关系无相关性。

结核杆菌;巨噬细胞;铁蛋白;铁转运蛋白

①本文为国家自然科学基金资助项目（No.81260261，81160192，81260241，81160001）和新疆生产建设兵团医药专项资金资助项目（No.2012BA022）。

②新疆阿克苏地区第二人民医院检验科，阿克苏843000。

③新疆医科大学第五附属医院烧伤整形科，乌鲁木齐830011。

④新疆乌鲁木齐市第一人民医院内一科，乌鲁木齐830000。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明种小鼠，6～8周龄，体重（18±2）克，雌雄各半，共120只，购自石河子大学实验动物中心。

1.1.2 菌株 结核杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株购自中国药品生物制品检定所。

1.1.3 主要材料及来源 DMEM培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司），台盼兰（美国Sigma公司），小鼠铁转运蛋白ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司），小鼠铁蛋白ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司），兔抗小鼠Fn单克隆抗体（Epitmics公司），HRP山羊抗兔二抗（北京康为生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 将实验小鼠随机分为H37Rv菌株组、BCG菌株组和空白对照组，每组各40只小鼠，共120只小鼠，按感染模型复制成功后第1、3、5、7、9、11、13、15 天设置 8 个时间点，每个时间点各设5只小鼠。

1.2.2 小鼠感染模型建立 在生物安全柜内，以灭菌接种环取改良罗氏固体培养基上生长2～3周状态良好的结核杆菌菌落，置灭菌磨菌器中，加少量0.05%Tween-20的生理盐水充分研磨，使其成均匀浑浊的菌悬液。利用麦氏比浊法调细菌浓度约1.0×107个/ml。将不同菌悬液经小鼠尾静脉分别注射到对应分组的每只小鼠体内，注射量约为0.3 ml。将感染小鼠置生物安全三级实验室内，IVC笼具中饲养。

1.2.3 小鼠肺泡巨噬细胞的收集 在上述不同时间点，将小鼠脱颈处死，摘眼球取血，暴露支气管，用消毒好的剪刀在气管上做一切口，用连有注射器的无菌软皮管从切口处插入气管，丝线固定，用4℃预冷PBS液行气管肺泡灌洗，每次1 m l，共10次，离心管收集支气管肺泡灌洗液，4℃ 1 500 r/min离心10 min，弃上清，加入含10% 胎牛血清的DMEM培养液，转入细胞培养瓶中。置37℃、5%CO2孵箱中培养4 h，贴壁细胞即为小鼠肺泡巨噬细胞。

1.2.4 各组小鼠肺泡巨噬细胞蛋白提取 将提取的小鼠肺泡巨噬细胞置于培养瓶中，培育4 h后，将培养瓶内营养液吸干净，每瓶加100μl的SDS蛋白裂解液，冰水浸泡裂解30 min，然后用小刮子将其刮出，水中煮沸15 min，4℃离心16 min，取上清。

1.2.5 利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞FPN的表达 按照ELISA方法检测转铁蛋白受体试剂盒操作说明进行操作。按50、40、30、20、10、0 ng/ml分别配制标准工作液，加入酶标测定板中，100μl/孔。其他孔中加入相同体积的待测上清样品，酶标板加盖，37℃反应40 min，洗涤5次，每孔加50μl生物素抗小鼠铁蛋白工作液，37℃反应20 min，洗涤3次，加酶标抗体工作液100μl/孔，37℃反应10 min，洗涤5次，加 TMB显色液，90μl/孔，37℃避光反应20 min，最后加TMB终止液100μl/孔，在酶标仪450 nm波长下读取各孔吸光度，绘制标准曲线，按标准曲线计算各样本的铁蛋白含量。

1.2.6 利用ELISA检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn的表达 操作步骤和方法同FPN的测定，不同的是标准工作液按 100、50、25、10、5、0 ng/ml进行配置。

1.2.7 利用Western blot技术动态检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn的表达 取上述提取的各组小鼠肺泡巨噬细胞提取的蛋白，将核酸蛋白测定仪模式调至A280，测定总蛋白的浓度，以最小浓度所在的蛋白组为标准，用裂解液稀释，使得各组蛋白浓度一致。将蛋白质上样缓冲液5μl与蛋白液20μl混匀，煮沸10 min，冰上冷却5 min。上样液体在4℃13 000 r/min离心5 min，取上清上样，80 V恒压电泳30 min，待溴酚蓝迁移至分离胶后改为110 V恒压电泳90 min。将PVDF膜裁剪好后，在甲醇中浸泡5 min，放入转膜缓冲液中，将Walkman滤纸泡入转膜液约15 min。按照Walkman滤纸、聚丙酰胺凝胶、PVDF膜、Walkman滤纸的顺序从上到下。23 V恒压半干转膜20 min，再将PVDF膜置入含50 g/L脱脂奶粉的TBS-T中，封闭2 h。将PVDF膜放入兔源性抗Fn抗体TBS-T溶液中（1∶1 000）4℃孵育过夜。次日，TBS-T洗涤PVDF膜，5 min/次洗膜1次、10 min/次洗膜3次，共4次。PVDF膜放入辣根酶标记山羊抗兔IgG的二抗中（1∶15 000），室温孵育1 h。TBS-T洗膜3次，10 min/次，用ECL发光试剂进行发光显色，在化学发光成像系统中拍照，用Quantity One软件进行分析。

1.3 统计学分析 应用SPSS16.0软件对数据进行统计处理，所得数据均以x－±s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞FPN的表达 结核杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞后，FPN的表达随着时间延长逐渐减弱，第5天时表达量开始明显下降，于第7、9天表达量最低。在H37RV株组内各时间点比较，于第5、7、9天降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1和图1）。在BCG组内各时间点比较，于5、7、9天FPN表达量同样减弱，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1和图1）。H37Rv株组与BCG组之间差异较小，无统计学意义。H37Rv株组于第5、7、9天与对照组比较，差异显著，差异有统计学意义（P＜0.05，见表1和图1）。BCG组于第5、7、9天与对照组比较，差异显著，有统计学意义（P＜0.05，见表1和图1）。

2.2 利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞内Fn的表达 结核杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞后，Fn的表达随着时间延长逐渐减弱，第7天时表达量最少。在H37Rv株组内各时间点比较，于第7、9、11天降低，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2和图2）。BCG组于7、9、11 d Fn表达量同样减弱，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2和图2）。H37Rv株组与BCG组之间差异较小，差异无统计学意义。H37Rv株组于第7、9、11天与对照组比较，差异显著，有统计学意义（P＜0.05，见表2和图2）。BCG组于第7、9天与对照组比较，差异显著，有统计学意义（P＜0.05，见表2和图2）。

表1 各组各时间点感染小鼠巨噬细胞FPN表达水平比较（±s）Tab.1 Expression of FPN in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

表1 各组各时间点感染小鼠巨噬细胞FPN表达水平比较（±s）Tab.1 Expression of FPN in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 7.10 ±0.45 6.86 ±0.06 7.43 ±0.13 3 5 5.75 ±0.51 4.11 ±0.06 7.58 ±0.19 5 5 3.33 ±0.441）2）3.01 ±0.061）2）7.49 ±0.14 7 5 2.80 ±0.351）2）2.14 ±0.051）2）7.79 ±0.18 9 5 2.81 ±0.311）2）2.16 ±0.051）2）7.15 ±0.12 11 5 5.22 ±0.89 4.54 ±0.04 7.38 ±0.30 13 5 6.07 ±0.41 5.91 ±0.03 7.64 ±0.13 15 5 6.81 ±0.55 6.63 ±0.07 7.11 ±0.09

图1 ELISA技术检测各组感染后小鼠肺泡巨噬细胞FPN的表达Fig.1 ELISA analysis of FPN expression in culturemedium of infected mouse alveolar macrophages

2.3 利用Western blot技术动态检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn的表达 利用Western blot技术，于第1、3、5、7、9、11、13、15 天动态检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn蛋白的表达，在蛋白分子量约20 kD处各有一条特异性蛋白带（见图3）。在7、9、11 d时，BCG组与H37Rv株组小鼠肺泡巨噬细胞Fn蛋白的表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。H37Rv组与BCG组相比较，无明显统计学差异。结核杆菌感染宿主巨噬细胞，可诱导小鼠肺泡巨噬细胞Fn蛋白的表达降低，但表达的高低与毒力的强弱无关（见表3和图4）。

表2 各组各时间点感染小鼠巨噬细胞Fn表达水平比较（±s）Tab.2 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

表2 各组各时间点感染小鼠巨噬细胞Fn表达水平比较（±s）Tab.2 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages culturemedium（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 4.93 ±0.09 4.88 ±0.09 4.79 ±0.13 3 5 4.97 ±0.06 5.01 ±0.12 4.71 ±0.19 5 5 4.55 ±0.15 4.99 ±0.16 4.89 ±0.14 7 5 3.92 ±0.151）2）3.46 ±0.161）2） 4.73 ±0.18 9 5 4.05 ±0.131）2）4.08 ±0.121）2） 4.89 ±0.12 11 5 3.99 ±0.091）2）4.26 ±0.151）2） 5.09 ±0.30 13 5 5.10 ±0.11 5.11 ±0.09 4.95 ±0.13 15 5 5.05 ±0.11 5.09 ±0.08 4.77 ±0.09

图2 ELISA技术检测各组感染后小鼠肺泡巨噬细胞Fn的表达Fig.2 ELISA analysis of Fn expression in culturemedium of infected mouse alveolar macrophages

图3 W estern blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn表达Fig.3 Analysis of expression of Fn in mouse alveolar macrophages by W estern blot

表3 各组各时间点感染小鼠肺泡巨噬细胞Fn表达水平比较（± s）Tab.3 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages（±s）

表3 各组各时间点感染小鼠肺泡巨噬细胞Fn表达水平比较（± s）Tab.3 Expression of Fn in infected mouse alveolar macrophages（±s）

Note:1）P ＜0.05 vs control group;2）P ＜0.05 vs the same group.

Time（Day） n BCG H37Rv Control 1 5 2.02 ±0.17 2.21 ±0.05 2.32 ±0.04 3 5 2.18 ±0.13 2.34 ±0.12 2.47 ±0.07 5 5 1.94 ±0.05 2.30 ±0.03 2.35 ±0.01 7 5 1.31 ±0.121）2）1.04 ±0.141）2）2.05 ±0.12 9 5 1.24 ±0.091）2）1.15 ±0.061）2）2.27 ±0.07 11 5 1.04 ±0.161）2）1.28 ±0.111）2）2.23 ±0.03 13 5 2.09 ±0.11 2.35 ±0.13 1.97 ±0.11 15 5 2.42 ±0.03 2.06 ±0.07 2.24 ±0.08

3 讨论

图4 小鼠肺泡巨噬细胞Fn在不同时间段的蛋白表达水平Fig.4 Expression of Fn inmouse alveolarmacrophages in different phases

宿主巨噬细胞与结核杆菌之间相互作用的结果，决定了结核杆菌感染的后果以及结核病的发生与否。本实验研究设想这一调控机制可能与调控宿主巨噬细胞的铁代谢作用相关。当结核杆菌感染宿主巨噬细胞以后，一方面要从感染的宿主巨噬细胞内摄取一定量的铁，以保证自身在宿主巨噬细胞内的生存、繁殖和分化的需要，同时另一方面还要调控感染宿主巨噬细胞的铁代谢，以避免感染宿主巨噬细胞内铁含量增加或降低，避免宿主巨噬细胞发生应激和凋亡。感染宿主巨噬细胞发生应激和凋亡，能够杀死寄生于其内的结核杆菌，阻止结核杆菌在体内的播散，并能激活邻近未感染的巨噬细胞，增强机体对结核杆菌的杀伤能力［1］。

对于结核杆菌来说铁是必需的，并且是有潜在毒性的营养物质。由于在有氧条件下游离铁并没有在机体内发现。所以结核杆菌需要一套特殊的铁摄取系统，来完成自身的复制。结核杆菌的铁摄取系统严格地控制铁代谢和胞内铁的水平，以防止铁介导的毒性，导致结核杆菌死亡。结核杆菌合成两个铁贮存蛋白，铁蛋白（BfrB）和细菌铁蛋白（BfrA）。

蛋白的变化的反应是不明确的。有研究通过基因敲除方法，对结核杆菌BfrA和BfrB蛋白进行了功能测定。研究结果表明:结核杆菌的铁蛋白并没有维持铁稳态的作用，并且结核杆菌很容易受到因缺乏铁而导致的铁介导的毒性，无法在小鼠体内形成慢性感染［2］。

铁代谢的紊乱已被证明可以显著地影响宿主对感染的免疫反应。在研究中，利用小鼠J774巨噬细胞过表达铁转运蛋白来研究铁代谢对感染免疫中一氧化氮（NO）释放的影响。在感染早期，过表达的铁转运蛋白显著抑制胞内的结核杆菌的生长。当巨噬细胞受到脂多糖（LPS）或结核杆菌的攻击时，NO的合成增加，但巨噬细胞表达铁转运蛋白则明显降低。当过表达铁转运蛋白的J744细胞受到脂多糖（LPS）或结核杆菌的攻击时，iNOS蛋白的表达上调显著降低。从而限制了这些巨噬细胞的杀菌活性。促炎性细胞因子γ干扰素可以扭转铁转运蛋白的过度表达对NO抑制作用。这些研究结果提示了一种新的铁转运蛋白的作用在减弱巨噬细胞介导的免疫反应。

有实验证据表明，铁营养状况影响巨噬细胞的先天免疫反应，包括产生一氧化氮（NO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）。在结核杆菌感染后引起小鼠巨噬细胞iNOS的表达上调和NO生产增加［3-5］。Donovan等［6］通过使用螯合剂和外加铁来操纵细胞的铁的含量，表明宿主细胞铁状态和iNOS的表达之间呈反比关系。在他们的模型中，细胞内铁的含量增加iNOS活性下降，而铁耗尽后又导致iNOS活性增强［6］。铁对这种iNOS活性逆效应被认为是iNOSmRNA表达水平改变的结果［6］。

巨噬细胞的网状内皮系统通过吞噬和降解受损或衰老的红细胞来获得铁［7］。铁被吸收后可以被存储在铁蛋白中。巨噬细胞通过铁转运蛋白将铁转运出胞内进入血浆［8，9］。到目前为止，铁转运蛋白是唯一已经被确立的铁的转出通道［10-12］。本实验对结核分枝杆菌感染后的小鼠肺泡巨噬细胞的铁蛋白和铁转运蛋白进行测定，研究铁代谢在结核分枝杆菌感染过程中的作用。

本实验利用ELISA方法和Western blot技术检测各组小鼠肺泡巨噬细胞Fn表达，结果显示:于模型建成后第7、9、11天，H37Rv组与BCG组的小鼠肺泡巨噬细胞Fn表达量明显减低，并且于第7天时表达量最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。利用ELISA方法检测各组小鼠肺泡巨噬细胞FNP表达，结果显示:不同毒力菌株感染小鼠肺泡巨噬细胞后，各感染组内巨噬细胞 FPN随处理时间延长表达逐渐降低;于感染第5天开始下降明显，第7、9天最低。H37Rv株组和BCG组表达相似，于第5、7、9天明显低于正常对照组FPN的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

通过研究发现，结核杆菌感染小鼠肺泡巨噬细胞以后，巨噬细胞内铁代谢发生一系列改变。铁蛋白与铁转运蛋白都呈下降趋势，这与结核杆菌急性感染宿主以后需要争夺小鼠肺泡巨噬细胞内的铁元素有关。小鼠肺泡巨噬细胞内铁元素含量的改变，使机体发生一系列的感染免疫反应，来对抗结核杆菌的感染。通过本实验的研究也为我们提供了治疗结核病的新思路与方法。

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［2］ Pandey R，Rodriguez GM.A ferritin mutant ofmycobacterium tuberculosis is highly susceptible to killing by antibiotics and is unable to establish a chronic infection in mice［J］.Infect Immun，2012，80（10）:3650-3659.

［3］ Abboud S，Haile DJ.A novelmammalian iron-regulated protein involved in intracellular iron metabolism［J］.JBio Chem，2000，275:19906-19912.

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［5］ De Domenico，McVeyWD，Nemeth E，et al.Molecular and clinical correlates in iron overload associated withmutations in ferroportin［J］.Haematologica，2006，91:1092-1095.

［6］ Donovan，Lima CA，Pinkus JL，et al.The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis［J］.Cell Metab，2005，1:191-200.

［7］ Knutson M，Wessling-Resnick M.Iron metabolism in the reticuloendothelial system［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2003，38:61-88.

［8］ KnutsonM，Oukka DM，Koss LM，et al.Iron release from macrophages after erythrophagocytosis is up-regulated by ferroportin1 overexpression and down-regulated by hepcidin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:1324-1328.

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［收稿2013-10-11 修回2013-12-27］

（编辑 张晓舟）

Effect on expression of macrophages ferroportin and ferritin in mouse alveolar macrophages by m ycobacterium tuberculosis

ZHUANGRui，WANGXia，ZHANGFeng，BAOYin，ZHANGLe，WUFang，WUJiang-Dong，ZHANGChun-Jun，ZHANGHui，LIWen-Juan，LIANGChen，FANChao，ZHANGWan-Jiang.DepartmentofPathophysiology，Medical School，ShiheziUniversity/LaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDiseases，ShiheziUniversity，Shihezi832002，China

Objective:To discuss the change of ferritin（Fn）and ferroportin expression quantity and time-related feature in the alveolarmacrophages ofmice，infected with different virulence ofMycobacterium Tuberculosis infected.Methods:The prepared bacteria of H37Rv or BCG were injected intravenously into themice tails.On the day 1，3，5，7，9，11，13 and 15，the lavage fluidswere collected and the alveolar macrophages were obtained from each group of mice.The expression of FPN and Fn were detected with ELISA and/orWestern blotanalysis.Results:The expression of Fn in the group ofeither H37Rv or BCG infectedmicewas decreased on the day 7，9 and 11，and was lowest on the day 7，which showed significantly statistical difference compared to that on the other days（P ＜0.05）.The expression of FNP in the infected mousemacrophage was decreased gradually，which was obvious on the day 5.The expression levels reached to the lowest on the day 7 and 9.The expression wasmuch lower than that in the negative control group（P ＜0.05）.Conclusion:The expression of Fn and FPN inmacrophages isolated from lungs ofmice infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv or BCG become decreased，and there is no difference between these two infected mouse groups.

book=592,ebook=328

Mycobacterium tuberculosis;Macrophage;Ferritin;Ferroportin

R378

A

1000-484X（2014）05-0591-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.004

庄 睿（1986年－），男，主要从事感染性疾病的病理生理学研究，E-mail:z176103165@163.com。

及指导教师:张万江（1967年－），男，教授，医学博士，博士生导师，主要从事感染性疾病的发病机制与防治研究，E-mail:zwj1117@sina.com。