口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

/李金海（四川农业大学动物医学院猪病研究中心，四川雅安 625014），李兴玉，曹三杰…//中国人兽共患病学报.-2013，29（4）.-380～384，407

目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒（FMDV）的一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果，设计特异性引物和MGB探针；通过优化，得到最佳反应体系和反应条件；分别以质粒和病毒RNA为模板，构建标准曲线；并进行特异性、敏感性、重复性试验。结果该方法能特异性检测A型、O型、Asia 1型FMDV，而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性；构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系，检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL，检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL，比多重RT-PCR敏感性高10倍；对4份样品进行5次批内和批间重复检测，检测结果变异系数均小于2%。结论建立的口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好，可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。