高效液相色谱法测定仙灵骨葆胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量

吴春园 王俊 高锦飚

高效液相色谱法测定仙灵骨葆胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量

吴春园 王俊 高锦飚

目的 采用高效液相色谱法测定仙灵骨葆胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量。方法 依利特Hypersil C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流速：1.1 ml/min；乙腈-0.05%磷酸(30：70)为流动相,检测波长：212 nm。结果 川续断皂苷Ⅵ质量浓度在4.36~87.20 μg/ml(r=0.9997)时与峰面积呈良好的线性关系, 平均加样回收率为98.37%, RSD(n=6)为1.25%。结论 该方法测定结果准确、灵敏、重复性好。

仙灵骨葆胶囊；川续断皂苷Ⅵ；高效液相色谱法

仙灵骨葆胶囊为中药复方制剂, 处方源于国家中成药标准汇编骨伤科分册, 由续断、淫羊藿、丹参、知母、补骨脂、地黄等6味药物组成［1］, 具有滋补肝肾, 活血通络, 强筋壮骨的功效, 可用于肝肾不足、瘀血阻络所致骨质疏松症的治疗［2］。本文采用HPLC法对续断中川续断皂苷Ⅵ进行含量测定方法学研究, 为今后完善该品种质量标准提供参考。

1 材料与方法

1.1试药与仪器 LC-10ATVP型高效液相色谱仪(型号：日本岛津)；ANASTAR色谱数据工作站；紫外可见检测器(型号：SPD-1OAVP)；川续断皂苷Ⅵ对照品(批号：111685-201305)来源于中国食品药品检定研究院；仙灵骨葆胶囊(市售；规格为每粒装0.5 g；批号分别为140302、140303、140307)；磷酸为分析纯, 购于广州化学试剂二厂；乙腈为色谱纯, 购于天津市康科德科技有限公司。

1.2色谱条件及系统适应性 C18色谱柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；采用乙腈-0.05%磷酸(30：70)为检测流动相；检测波长为212 nm；流速为1.1 ml/min。在上述色谱条件下川续断皂苷Ⅵ与其他组分的分离效果良好, 以川续断皂苷Ⅵ计理论塔板数应不低于3500, 分离度不低于1.5。

1.3检测波长的选择 称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量, 置50 ml量瓶中, 加入流动相溶解并稀释至刻度, 制得0.10 mg/ml［3,4］的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液, 按照中国药典附录中紫外-可见分光光度法检测方法检测［3,4］, 检测波长定为200~400 nm,扫描结果显示川续断皂苷Ⅵ对照品在212 nm的波长处有最大吸收, 因此将川续断皂苷Ⅵ的检测波长定为212 nm。

1.4对照品溶液的制备 精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量, 置20 ml具塞容量瓶中, 加65%甲醇溶解并稀释至刻度,制成0.4360 mg/ml的对照品储备溶液。精密吸取上述对照品储备溶液5 ml, 置50 ml具塞容量瓶中, 加65%甲醇稀释至刻度, 摇匀, 即得0.0436 mg/ml的对照品溶液。

1.5供试品溶液的配制 取仙灵骨葆胶囊数粒, 倾出内容物, 除去胶囊壳, 研细, 取约0.5 g, 精密称定, 置100 ml容量瓶中, 加65%甲醇至刻度, 超声波(100W, 40 kHz)超声处理30 min, 采用65%甲醇补充减失的重量, 振摇, 采用微孔滤膜进行过滤, 所得滤液作为供试品溶液。

1.6阴性对照溶液的配制 按仙灵骨葆胶囊处方比例称取除续断外的其余药材, 按照仙灵骨葆胶囊的生产工艺制成续断空白样品, 按照“1.5”项下的供试品溶液的制备方法制成续断空白对照溶液。

2 结果

2.1阴性对照试验 分别精密吸取10 ul的供试品溶液、对照品溶液及空白对照溶液, 按“1.2”项的色谱条件进行检验,检验结果显示：供试品溶液的色谱图中, 在与川续断皂苷Ⅵ对照品相同保留时间处有吸收峰, 而空白对照溶液在该组分保留时间处未显示吸收峰。

2.2线性关系考察 分别精密吸取“1.4”项下川续断皂苷Ⅵ对照品储备溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ml, 分别置于5个 10 ml的容量瓶中, 加65%甲醇稀释至刻度, 摇匀。按“2.1”项下色谱条件进行分析测定, 以峰面积Y与对照品质量浓度X, 得川续断皂苷Ⅵ回归方程为： Y=2.0648×104X+326.9, r=0.999 7, 线性范围为4.36~87.20 μg/ml。结果表明：川续断皂苷Ⅵ在其线性范围内, 所测组分质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.3精密度实验研究 取“1.4”项下的川续断皂苷Ⅵ对照品溶液按照“1.2”项下色谱条件, 重复进行6次进样, 分别记录续断皂苷Ⅵ的峰面积, 实验结果显示, 该仪器具有良好的精密度, 川续断皂苷Ⅵ的RSD为0.72%, 符合规定要求。

2.4重现性实验研究 称取同一批号供试品, 按”1.5”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液, 按照“1.2”项下色谱条件依法进样测定, 川续断皂苷Ⅵ的RSD为0.45%。本法测定重现性良好。

2.5稳定性实验研究 取同一批号产品的同一供试品溶液,分别在放置0、2、4、6、12、24 h后精密吸取10 μl进样,测定其峰面积值, 川续断皂苷Ⅵ的RSD为0.81%, 供试品溶液在放置24 h内基本稳定。

2.6加样回收率试验 取川续断皂苷Ⅵ含量为8.26 mg/g的同一批样品适量, 倾出内容物, 研细, 取约0.25 g, 精密称定, 置100 ml容量瓶中, 加对照品溶液25 ml、65%甲醇25 ml, 超声波(100 W, 40 kHz)超声处理30 min, 采用65%甲醇补充减失的重量, 振摇, 采用微孔滤膜进行过滤, 所得滤液作为加样供试品溶液［5-8］。按上述含量测定方法测定其峰面积, 计算回收率, 川续断皂苷Ⅵ平均加样回收率为98.37%, RSD(n=6)为1.25%。结果表明本方法回收率良好。

2.7样品测定 取3批样品测定川续断皂苷Ⅵ的含量, 川续断皂苷Ⅵ分别为4.13、4.27、3.98 mg/片。

3 讨论

流动相选择时分别以乙腈一水(30:70)、甲醇一水(30:70)和乙腈-0.05%磷酸(30：70)为流动相, 结果甲醇一水(30:70)分离效果不好, 未达到基线分离；乙腈一水(30:70)川续断皂苷Ⅵ峰形不对称, 拖尾现象严重；而乙腈-0.05%磷酸(30:70)能达到基线分离, 峰形较好。故选用乙腈-0.05%磷酸(30:70)为流动相。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：中国医药科技出版社, 2010:309-310, 附录30, 附录36.

［2］ 彭键.高效液相色谱法测定跌打丸中川续断皂苷Ⅵ的含量.中南药学, 2012, 10(01):25-28.

［3］ 樊媛洁, 翟永松, 王满元.不同炮制方法对续断饮片中川续断皂苷Ⅵ、X含量的影响.中国实验方剂学杂志, 2013, 19(17): 22-24.

［4］ 卢凤来, 蒋海英, 陈月圆, 等.HPLC-ELSD法测定山银花中绿原酸、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙.中成药, 2013, 35(08):1821-1823.

［5］ 杨洁芳.LC-MS法同时测定骨康胶囊中6种主要成分的含量.中国药房, 2012, 23(35):3344-3346.

［6］ 付敏, 杨全伟, 韩建伟.HPLC法测定活络镇痛膏贴中川续断皂苷Ⅵ的含量.中国药师, 2013, 16(11):1748-1749.

［7］ 杨武德, 彭娇平, 冯静.高效液相色谱法测定黔不同产地的续断中川续断皂苷Ⅵ的含量.中国医院药学杂志, 2011(17):1469-1471.

［8］ 谷丹丹, 邓洪, 覃瑶, 等.正交设计优化川续断中川续断皂苷Ⅵ的提取工艺.时珍国医国药, 2013, 24(07):1587-1588.

2014-05-20］

213022 常州市新北区三井人民医院(吴春园)；金坛市人民医院(王俊)；南京中医药大学(高锦飚)