牦牛奶酪中乳酸菌对抗生素的药敏性

杨吉霞，陈芝兰，贺稚非,*，陈宗道

牦牛奶酪中乳酸菌对抗生素的药敏性

杨吉霞1，陈芝兰2，贺稚非1,*，陈宗道1

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工技术重点实验室，重庆 400715；2.西藏大学农牧学院科研处生物中心，西藏 林芝 860000）

分析牦牛奶酪中乳酸菌对常用抗生素的药敏性。采用纸片扩散法测定分离自牦牛奶酪的39 株乳酸菌对8 种常用抗生素的药敏性。结果表明：39 株乳酸菌都有耐药性，主要对万古霉素、新霉素、链霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分别达到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38株（97.4%）和39株（100%），菌株的耐药性有一定的种间差异，部分菌株有多重耐药性。

牦牛奶酪；乳酸菌；抗生素；耐药性

乳酸菌在食品领域中的应用主要有两个方面，一是发酵微生物，在发酵制作乳制品、肉制品、泡菜的过程中起着关键的作用，另一方面是作为益生菌，可定植于动物肠道中，发挥调节肠道菌群、增强免疫、降低血清胆固醇等益生功能[1-2]，从天然乳酸菌中发掘出了有优良益生功能的菌株，制作成含菌饮料、发酵乳制品、肠道微生态制剂等保健或者健康食品，有益生功能的乳酸菌也被广泛应用于饲料中，对于畜禽的日常保健有显著的功效[3]。

1980年国外学者研究了乳酸菌的药敏性[4-5]，发现它们对抗生素有耐药现象。乳酸菌作为益生菌，它的耐药性有两方面的意义，一方面是积极的意义，当人或动物服用抗生素时，往往会把肠道中有益和有害的细菌同时杀灭，引起腹泻，如果乳酸菌对抗生素有抗性，就可以缓解这种不良反应，帮助宿主恢复肠道菌群平衡[6-7]，在动物饲料中，也常选用有耐药性的菌株，与抗生素配伍使用，在促进动物体内正常菌群的建立、提高畜禽生产能力方面起到协同增效的作用[8]。另一方面是负面的意义，乳酸菌以活菌的形式进入人或动物体内，在肠道内定殖，如果它携带耐药基因片段，而且位于质粒或者转座子上，耐药基因片断就有可能通过水平转移传递给肠道中的致病菌，导致致病菌获得耐药性[9]。传统发酵食品中的乳酸菌也有可能将耐药基因片段传递给环境中的致病菌，使致病菌获得耐药性。

乳酸菌的食用历史长达数千年，安全性是公认的，被美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）认定为“一般公认安全（generally recognized as safe，GRAS）”的微生物[1]。国外学者对乳酸菌耐药性和相关基因进行了一系列的研究，提出耐药性问题是乳酸菌在应用安全方面的首要问题[10]。我国对乳酸菌药敏性研究工作相对较少，冯大伟[11]、徐进[12]、李平兰[13]等研究了益生乳酸菌的药敏性，凡琴[14]、周林[15]、魏新元[16]等研究了酸奶中的乳酸菌的药敏性，马艳[17]和甄丽[18]等研究了饲料乳酸菌的药敏性。大部分研究主要集中于工业菌株，而对传统发酵食品中的天然乳酸菌报道很少，胡勇[19]研究了青海部分酸奶中乳杆菌的药敏性。我国传统发酵乳制品中蕴藏着种类丰富的乳酸菌，是潜在的益生菌株和工业发酵菌株的重要来源，研究它们对常用抗生素的药敏性，对于它们在益生或者发酵方向的应用有重要的参考价值。

纸片扩散法是分析乳酸菌药敏性最基本的方法，对实验条件要求低、操作简单，但是至今仍然没有标准的实验方法，主要是培养基和评判标准不统一。本研究总结了国内外纸片扩散法的实验方法，分析分离自牦牛奶酪的39 株乳酸菌对8 种常用抗生素的抗性，以期为它们在益生或者发酵方向的应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试菌株为分离自牦牛奶酪的39 株乳酸菌，菌株编号为1～39，数字前用字母表示采样地点，T（西藏），Y（云南），X（新疆），如表1所示，它们的分离鉴定已在另一篇论文中报道[20]。采用金黄色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923 作为质控菌株。1.1.2 试剂与培养基

表1 供试菌株16S rRNA序列鉴定结果Table 1 Species identification of the strains isolated from yak milk cheese by 16S rRNA sequence analysis

氨苄青霉素钠盐、氯霉素、红霉素、新霉素硫酸盐、萘啶酮酸、链霉素硫酸盐、四环素盐酸盐、万古霉素盐酸盐 北京拜尔迪生物公司；麦氏比浊管（McFarland） 生物梅里埃中国有限公司；MRS培养基和胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy agar，TSA）培养基青岛海博生物技术公司。

1.1.3 药敏纸片的制备

用滤纸片制成直径为7 mm的圆形纸片，让纸片完全吸附不同效价的抗生素，分别为氨苄青霉素（ampicillin，Am，10 μg）、氯霉素（chloramphenicol，C，30 μg）、红霉素（erythromycin，E，15 μg）、新霉素（neomycin，N，30 μg）、萘啶酮酸（nalidixic acid，NA，30 μg）、链霉素（streptomycin，S，10 μg）、四环素（tetracycline，TE，30 μg）、万古霉素（vancomycin，VA，30 μg），剂量参照美国临床实验室标准化研究所（Clinicaland Laboratory Standards Institute，CLSI/NCCLS）2012版的规定[21]。

1.2 方法[21-22]

用MRS液体培养基转接菌株两次，得到活化的菌株。在9 cm培养皿中倒入15 mL MRS琼脂培养基，取200 μL活化菌液（混浊度相当于1 McFarland，即3.0×108CFU/mL）（加入4 mL 软琼脂（0.6%琼脂，45 ℃）混匀，此时软琼脂中活细胞浓度控制在1.5×107CFU/mL，将软琼脂均匀地铺在MRS固体培养基上，于室温下放置大约15 min，待上层琼脂冷却凝固并适当干燥，然后将含有抗生素的药片用无菌操作贴放在琼脂表面，于37 ℃培养24 h，用尺子测抑菌圈直径，读数至毫米，取6 次测量的平均值作为结果。质控菌株S. aureus ATCC 25923的培养和保藏用TSB培养基，药敏性实验用MRS培养基，用来监控实验的精确性和准确性。每个实验重复3 次。

供试菌株对8 种抗生素的药敏性判断标准参照文献[22]，列于表2中。

表2 抗生素抗性的判断标准Table 2 Standards for judgment antibiotic resistance

2 结果与分析

2.1 质控菌株的耐药性实验

质控菌株S. aureus ATCC 25923的耐药性实验如图1所示，抑菌圈直径如表3所示。一般用MH培养基测质控菌株的药敏性，本实验测出该菌株在MRS培养基上也能生长，抑菌圈直径都在有效范围之内，说明质控菌株和待测菌株可以统一采用MRS培养基，抗生素都是有效的，实验方法的建立是正确的。

图1 质控菌株S. aureus ATCC 25923的耐药性实验照片Fig.1 Photographs showing antibiotic resistance of reference strain S. aureus ATCC 25923

表3 质控菌株S. aureus ATCC 25923的耐药性Table 3 Antibiotic resistance of reference strain S. aureus ATCC 25923

表4 乳酸菌对抗生素的抗性Table 4 Antibiotic resistant patterns of the isolated lactic acid bacteria

2.2 待测菌株的耐药性实验

本研究总结了国内外文献中分析乳酸菌耐药性所用的纸片扩散法，主要有以下几个要点：1）培养基：MRS培养基（pH 6.8）适合于乳杆菌培养，被广泛用于乳杆菌的药敏测试。2）菌液浓度：本研究将菌液浓度控制在1.5×107CFU/mL，平行实验抑菌圈直径稳定。3）接种方式采用倾注法，平行实验抑菌圈直径稳定。4）评判标准：国内外文献对乳酸菌的药敏性没有明确的判断标准，Charteris等[22]提供了44 种抗生素敏感、中度敏感和抗性的抑菌圈直径范围，被广泛引用。

由表4可知，从菌种的角度来分析，本研究中的39 株乳酸菌分别属于9 个菌种：L. buchneri，L. casei，L. diolivorans，L. fermentum，L. helveticus，L. kefiri，L. plantarum，P. acidilactici，P. pentosaceus，乳酸菌的耐药性表现出一定的种间差异。例如，仅有3 株菌对万古霉素敏感，而这3 株菌都是L. helveticus。对于新霉素敏感的菌株只有7 株，L. diolivorans的3 株菌1 株敏感2 株中度敏感，相对于其他菌种来说有较强的敏感性。对于四环素敏感的菌株有17 株中度敏感7 株，L. casei的16 株菌中有15 株敏感1 株中度敏感，相对于其他菌种来说有很强的敏感性，而L. diolivorans的3 株菌都对四环素有抗性。Danielsen等[23]指出，乳酸菌的耐药性存在属间或者种间的差异，有必要将药敏实验数据与乳酸菌的菌种结合起来分析，更能够解析乳酸菌的药敏性。

本研究中的菌株表现出多重耐药性，21 株菌的耐药谱为“万古霉素-新霉素-链霉素-萘啶酮酸”，占总菌株数的53.8%，6 株菌的耐药谱为“万古霉素-链霉素-四环素-萘啶酮酸”，占总菌株数的15.4%，4 株菌的耐药谱为“万古霉素-新霉素-链霉素-四环素-萘啶酮酸”，占总菌株数的10.3%。菌株T4对8 种抗生素都有抗性，是耐药谱最广的菌株，其次是T5，对7 种抗生素有抗性，T7、Y13和Y18对6 种抗生素有抗性。

表5 乳酸菌对8 种抗生素的敏感性统计数据Table 5 Statistical data for the susceptibility of the 39 lactic acid bacterial strains to 8 antibiotics

由表5可知，从抗生素的角度分析，39 株乳酸菌主要对万古霉素、新霉素、链霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分别达到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38 株（97.4%）和39 株（100%）。已有较多的文献报道了乳酸菌对万古霉素的抗性，例如，Hamilton-Miller[24]和Simpson[25]等报道了Lactobacilli、Pediococci和Leuconostoc spp.对万古霉素有天然的抗性，Elisha等[26]报道了L. plantarum、L. casei、L. salivarius、L. leishmannii和L.acidophilus由于体内有D-丙氨酸和D-丙氨酸连接酶，对万古霉素有天然的抗性。Danielsen等[23]报道了一些乳杆菌对链霉素有天然的抗性，Curragh等[27]也指出一些乳杆菌对链霉素有很高的自发突变频率，表现出耐药性。本研究测出39 株乳酸菌对万古霉素和链霉素有普遍的耐药性，与这些报道是一致的。乳酸菌对新霉素和萘啶酮酸药敏性研究报道比较少。

乳酸菌的耐药性有两种情况：一种是先天固有的耐药性，被认为是种的特性，其耐药基因片段通常随着菌株的繁殖遗传给下一代（垂直转移），不会转移给致病菌。另一种是获得性耐药性，其抗性基因片段有可能通过接合、转导等方式转移给其他菌株（水平转移），这种耐药性有可能通过水平转移传递给致病菌[9,28]。乳酸菌对万古霉素、链霉素和萘啶酮酸的耐药性是先天固有的，一般不会转移[9]。已有研究证明，一些乳杆菌如干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对万古霉素先天具有抗性，它们作为安全的益生菌使用已有多年的历史，没有发现抗万古霉素的特性转移给其他细菌，所以认为不必担心其安全性[29]。而本研究中乳酸菌对于新霉素普遍有抗性，这是比较值得注意的，需要检测抗生素抗性基因片段是否位于质粒上，进而判断这些菌株是否安全，是否可以作为人和动物的益生菌。

3 结 论

本研究采用分离自牦牛奶酪的39 株乳酸菌（分别属于9 个菌种）作为供试菌株，测试它们对8种常用抗生素的药敏性。研究结果表明39 株乳酸菌都有耐药性，主要对万古霉素、新霉素、链霉素和萘啶酮酸有抗性，抗性菌株分别达到了36 株（92.3%）、32 株（82.1%）、38 株（97.4%）和39 株（100%），菌株的耐药性有一定的种间差异，部分菌株有多重耐药性。本研究的结果为这些乳酸菌在益生或者发酵方向的应用提供了参考数据。

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Antibiotic Susceptibility of Lactic Acid Bacteria Isolated from Yak Milk Cheese

YANG Ji-xia1, CHEN Zhi-lan2, HE Zhi-fei1,*, CHEN Zong-dao1
(1. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Product Processing, College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Center of Biology, Agricultural and Animal Husbandry College of Tibet University, Linzhi 860000, China)

Objective: The antibiotic susceptibility of 39 lactic acid bacterial strains isolated from yak milk cheese was evaluated in this study. Methods: Disc diffusion method was employed to test antibiotic susceptibility of these isolates to eight most widely used antibiotics, including ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, neomycin, nalidixic acid, streptomycin, tetracycline and vancomycin. Results: These strains primarily presented resistance to four antimicrobial agents: vancomycin, neomycin, streptomycin and nalidixic acid. The number of resistant strains was 36 (92.3%), 32 (82.1%), 38 (97.4%) and 39 (100%), respectively. There was variation in susceptibility between the species. Multidrug resistance was identified in most isolates. Conclusion: This study provides valuable data on these isolates for the consideration of application as probiotic bacteria or fermentation starters.

yak milk cheese; lactic acid bacteria; antibiotics; resistance

TS252.54

A

1002-6630（2014）17-0176-05

10.7506/spkx1002-6630-201417034

2013-08-21

杨吉霞（1978—），女，讲师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：yangjx@188.com

*通信作者：贺稚非（1960—），女，教授，博士，研究方向为食品微生物学。E-mail：zfhe2003@yahoo.com.cn