重组亚油酸异构酶诱导表达条件的优化

■张颜婷 赵国芬

(内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特010010)

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是具有共轭双键的位置和几何异构体十八碳烯酸的统称。其共轭双键通常位于C9和C11位或C10和C12位，每个双键可以以顺式或反式构型存在[1]。共轭亚油酸的立体异构体多达十几种，以cis-9,trans-11-CLA(c9t11)，trans-10、cis-12-CLA(t10c12)，trans-9、trans-11-CLA(t9t11)和 cis-10、cis-12-CLA(c10c12)等异构体为主，其中具有生物学功能的两种异构体为cis-9、trans-11-CLA(c9t11)和 trans-10、cis-12-CLA(t10c12)[2]。研究表明，CLA具有诸多的生理功能，如抗癌、调节血糖、增强肌体免疫力、促进骨组织代谢、促进生长发育[3-8]、治疗糖尿病[9]、减少皮肤感染[10]、减少脂肪[11]和抗动脉粥样硬化[12-13]等，其在食品和医药等领域已经成为研究的重点。

亚油酸异构酶(linoleic acid isomerase，LAI）可以专一地将亚油酸转化为共轭亚油酸。与目前应用较为广泛的化学异构法和微生物发酵法生产CLA相比，利用重组菌诱导表达并纯化产生的LAI催化亚油酸产生CLA，不仅可以获得高活性、高纯度的CLA，还解决了微生物发酵过程中发酵条件苛刻、菌体生产能力局限和菌体代谢产物不易与产品分离等问题。

本试验以重组LAI工程菌为试验菌株，对诱导时机、诱导时间、诱导剂浓度和诱导温度进行单因素试验和正交试验研究，以进一步优化重组LAI工程菌的诱导表达条件，为后续酶的纯化、利用以及工业生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

亚油酸纯度≥99%（Sigma）、氨苄青霉素（amresco）、IPTG（amresco）、牛血清白蛋白（Scientific Research Special）、正己烷（永大试剂）、蛋白胨（环凯微生物）、酵母提取物（环凯微生物）、Tris（amresco）、甘油（永大试剂）、咪唑（Vetec）、NaCl（永大试剂）、NTA-0、100、200、400分别为浓度20 mM Tris-HCl（pH值 7.9），0.5 M NaCl及10%甘油，添加0、100、200、400 mM咪唑、JM109-pQE30a-LAI(实验室保存)。

1.2 菌种培养

将-80℃保存的重组菌接种于固体LB培养基上，划线培养，37℃静置培养24 h，挑取单菌落接于液体LB培养基中，37℃摇床培养24 h即得种子液。

1.3 诱导条件优化的单因素试验

1.3.1 诱导时机的选择

将种子液接于液体培养基，在37℃摇床中分别培养1、3、5、7、10 h，培养结束后，向培养液中加入终浓度为1 mM IPTG继续37℃培养15 h。培养结束后离心收菌，PBS洗涤，破碎菌体进行酶活力的测定。

1.3.2 诱导时间的选择

将种子液接于液体培养基，在37℃摇床中培养7 h，培养结束后，向培养液中加入终浓度为1 mM IPTG继续37 ℃培养，培养时间分别为5、10、15、20、25 h。培养结束后离心收菌，PBS洗涤，破碎菌体进行酶活力的测定。

1.3.3 诱导剂浓度的选择

将种子液接于液体培养基，在37℃摇床中培养7 h，培养结束后，向培养基中加入IPTG，终浓度分别为0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM，继续37 ℃培养15 h，培养结束后离心收菌，PBS洗涤，破碎菌体进行酶活力的测定。

1.3.4 诱导温度的选择

将种子液接于液体培养基，在37℃摇床中培养7 h，培养结束后，向培养液中加入终浓度为0.1 mM IPTG继续培养，培养温度分别为20、25、30、37 ℃，继续培养15 h，培养结束后离心收菌，PBS洗涤，破碎菌体进行酶活力的测定。

1.4 诱导条件优化的正交试验

根据单因素试验结果，进行4因素3水平正交试验。

1.5 菌体的破碎

称菌体湿重，加入10倍体积的PBS，利用超声波破碎仪对菌体进行破碎。破碎后，离心所得的上清液即为粗酶液。

1.6 蛋白质含量的测定

利用考马斯亮蓝法[14]对蛋白质含量进行测定。

1.6.1 标准曲线的绘制

以PBS为溶剂，分别配制0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg∕ml的牛血清白蛋白溶液，分别取1 ml加入5 ml考马斯亮蓝G-250溶液，反应5 min后摇匀，测定OD595nm，以牛血清白蛋白质量（μg）为横坐标，OD595nm为纵坐标，绘制标准曲线。

1.6.2 样品的测定

取适当稀释后的样品1 ml加入5 ml考马斯亮蓝G-250溶液，反应5 min后摇匀，测定OD595nm，然后根据标准曲线计算样品的蛋白质含量。

1.7 酶活力的测定

1.7.1 标准曲线的绘制

以正己烷为溶剂，分别配制0、20、40、60、80、100、120、140、160 μg∕ml的CLA溶液，测定OD233nm，以CLA质量(μg)为横坐标，OD233nm为纵坐标，绘制标准曲线。

1.7.2 亚油酸悬浊液的制备

取亚油酸 0.5 ml，Tween-80 0.5 ml，用去离子水99 ml，超声乳化，即得亚油酸乳浊液。

1.7.3 酶活力的测定

取3 ml亚油酸乳浊液加入粗酶液200 μl，37℃振荡培养2 h，向反应液中加入10%三氯乙酸结束反应，再加入10 ml正己烷进行振荡萃取，测定OD233nm[15]。根据下述公式进行酶活力的计算。

式中：K——稀释倍数；

G——生成的CLA含量（μg）；

V——取酶液的体积（ml)；

T——反应时间（h）。

1.8 重组LAI诱导表达SDS-PAGE检测

以正交试验所得的最佳诱导表达条件对重组LAI进行诱导表达，对诱导表达效果进行SDS-PAGE检测。

2 结果

2.1 蛋白质含量标准曲线的绘制

以不同浓度牛血清白蛋白与考马斯亮蓝G-250反应后测定OD595nm值，以OD595nm为纵坐标，蛋白质的质量（μg）为横坐标，绘制标准曲线如图1。

图1 蛋白质含量标准曲线

由图1可知，蛋白质含量标准曲线方程的R2=0.997 7，标准曲线具有可信性，可以使用。

2.2 CLA含量标准曲线的绘制

在233 nm处测定不同CLA浓度的正己烷溶液的OD233nm值，以OD233nm为纵坐标，CLA的质量（μg）为横坐标，绘制标准曲线如图2。

图2 共轭亚油酸含量标准曲线

由图2可知，共轭亚油酸含量标准曲线方程的R2=0.999 3，标准曲线具有可信性，可以使用。

2.3 诱导条件的优化的单因素试验

2.3.1 诱导时机的选择

对诱导时机分别为1、3、5、7、10 h诱导表达的LAI粗酶液进行了酶活力测定，结果如图3。

图3 诱导时机的选择

由图3可知，随着诱导前菌体培养时间的延长，诱导表达的LAI的酶活力呈现先升后降的趋势，当诱导前培养时间为7 h时，酶活力最大达到3 074.5 U∕ml。由于IPTG能抑制菌体生长，过早的加入IPTG会导致重组菌菌体生物量偏低，产酶能力受限，此时诱导产生的酶活力较低；当重组菌生长进入对数期，随着菌体的快速增殖，重组菌的产酶能力升高，诱导产生的酶活力不断升高；当重组菌进入稳定期后，菌体数目不再增加，但由于菌体生长产生的代谢产物以及有害物质的积累，此时菌体的产酶能力与对数期时相比较差，诱导产生的酶活力有所下降。因此，重组LAI的最佳诱导时机为诱导前培养菌体7 h。

2.3.2 诱导时间的选择

对诱导时间分别为5、10、15、20、25 h诱导表达的LAI粗酶液进行了酶活力测定，结果如图4。

图4 诱导时间的选择

由图4可知，随着诱导时间的延长，诱导表达的LAI的酶活力呈现先升后降的趋势，当诱导时间达15 h时，酶活力达到最大，为3 182.3 U∕ml。由于培养时间为0～15 h时重组菌生长由延迟期到达稳定期，这一时期内LAI的诱导表达可以正常进行，所以酶活力不断上升；而随着时间的延长，20 h后重组菌生长进入衰亡期，菌体发生自溶和蛋白质降解现象，LAI也不可避免的被降解，所以酶活力出现下降的趋势。因此，重组LAI最佳诱导时间为15 h。

2.3.3 诱导剂浓度的选择

对诱导剂浓度分别为 0.05、0.10、0.50、0.80、1.00 mM诱导表达的LAI粗酶液进行了酶活力测定，结果如图5。

图5 诱导剂浓度的选择

由图5可知，随着诱导剂IPTG浓度的增加，诱导表达产生的LAI活力出现先升后降趋势，当IPTG浓度为0.1 mM时，LAI活力最大，可达2 527.1 U∕ml。由于诱导剂IPTG对于重组菌具有一定的毒害作用，低浓度的IPTG对重组菌毒害作用不明显，但是对LAI诱导表达的效率也相对较低，此时LAI活力不高；随着IPTG浓度的增加，IPTG对LAI诱导表达的效率增高，LAI活力增大；而当IPTG浓度进一步增高时，其对于重组菌的毒害作用也愈加明显，导致重组菌生长受限，不能很好地表达LAI，使得LAI活力降低。因此，重组LAI最佳诱导剂浓度为0.1 mM。

2.3.4 诱导温度的选择

对诱导温度分别为20、25、30、37℃诱导表达的LAI粗酶液进行了酶活力测定，结果见图6。

图6 诱导温度的选择

由图6可知，随着诱导温度的升高，诱导表达的LAI的酶活力出现先升后降的趋势，当温度为25℃时，LAI的酶活力最大，可达2 836.9 U∕ml。由于低温诱导酶表达时，酶可以正确折叠，但酶的表达速率低，总体表现为酶活力不高；而随着温度的升高，酶的表达速率加快，酶活力也逐渐升高；但当温度进一步升高时，酶折叠速率加快，致使形成的酶的高级结构的错误率增高，总体表现为酶活力降低，因此，25℃为LAI诱导表达的最佳温度。

2.4 诱导条件的优化的正交试验

根据正交试验因素水平表进行L9(34)正交试验，正交试验设计见表1，试验结果如表2和表3。

表1 正交试验因素水平

由表2可知，最佳诱导条件为：A2B1C3D3，即诱导时机为诱导前培养菌体7 h、诱导时间为10 h、诱导剂浓度为0.15 mM、诱导温度为30℃，各因素对正交试验影响强弱关系为：B＞D＞C＞A。由于最佳诱导条件在正交试验表中没有对应的试验组，在最佳诱导条件下进行3组平行验证试验，3组试验测得LAI酶活力结果分别为3 845.857 8、3 775.675 4、3 927.523 5 U∕ml，RSD=1.9741%，表明最佳诱导条件为A2B1C3D3时所得的LAI酶活力平均值为3 849.686 0 U∕ml。由表3可知，因素B、C、D对试验结果影响极显著，因素A对试验结果影响不显著。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

2.5 重组LAI的诱导表达的SDS-PAGE检测（见图7）

由图7可知，阴性对照菌JM109和JM109-pQE30a经IPTG诱导没有目的蛋白质产生，而重组菌JM109-pQE30a-LAI经IPTG诱导产生了目的蛋白质，且大小约为64 kD，与预期相符。这表明阴性对照菌本身并不产生LAI，只有转入了LAI基因的重组菌才能经IPTG诱导产生LAI，且产生的LAI大部分为可溶性的，有利于下一步亲和层析纯化LAI的进行。

图7 重组LAI诱导表达SDS-PAGE检测

3 结论

近年来，对于生物合成CLA的研究成为了食品和医药领域的热点，随着研究的深入，结合基因工程和酶工程的技术，纯化出高活性、高纯度的LAI，利用酶直接催化亚油酸产生共轭亚油酸的方法，显示出了显著的优越性。本试验通过对重组菌诱导培养条件的优化发现，最佳诱导条件为：诱导时机为诱导前培养菌体7 h，诱导时间为10 h，诱导剂浓度为0.15 mM，诱导温度为30℃。最佳诱导条件下，诱导出的亚油酸异构酶的酶活力平均可达3 849.686 0 U∕ml。与天然发酵法和化学合成法获得LAI相比，优化了诱导表达条件的重组菌诱导表达出的LAI，具有活性高、异构体单一、利于纯化等优点，为后续酶的利用、开发和研究奠定了一定的基础。