双歧杆菌优良菌株的筛选及耐消化道逆环境性能

熊 涛，黄巧芬，杜 曼

（南昌大学生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

双歧杆菌优良菌株的筛选及耐消化道逆环境性能

熊 涛，黄巧芬，杜 曼

（南昌大学生命科学与食品工程学院，食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

以改良MRS培养基作为选择性培养基，初筛得75 株严格厌氧且菌落呈蓝色的双歧杆菌疑似菌株。在pH3.0和含3.0 mg/mL胆盐的改良MRS培养基中培养20 h，得到吸光度较高的11 株，并选出耐酸耐胆盐较好的NCU712、NCU701、NCU708进行生理生化鉴定，NCU712基本符合长双歧杆菌的特征。经16S rDNA分子生物学鉴定菌株NCU712为长双歧杆菌。并在模拟人体消化道逆环境下对菌株NCU712的耐受力进行初步研究。结果表明：在pH 3.5以上的人工胃液中，NCU712活菌数随着作用时间的延长而略有上升；pH 2.5时菌株NCU712的D值为30.42 min；pH 3.0时D值为92.97 min，作用2.5 h活菌数保持在107CFU/mL以上；人工肠液作用4.0 h后，活菌数保持在108CFU/mL以上；3.0 mg/mL胆盐中培养24 h后，活菌数下降1（lg（CFU/mL））。说明NCU712对人体胃肠道耐受性良好。

双歧杆菌；筛选鉴定；消化道逆环境；耐受能力

双歧杆菌是人体肠道正常菌群，具有促进消化吸收[1]、通便、生物拮抗作用[2]、护肝、提高免疫力和抗癌[3]等功能。通常人体肠道内主要有婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌和长双歧杆菌。双歧杆菌作为典型的专性厌氧菌，常用亨盖特滚管、厌氧罐、厌氧袋及厌氧箱4 种厌氧技术培养，选择性培养基主要有LP、 MRS、TPY、PTGY、改良MRS等，改良MRS应用较广泛，且添加5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside，X-Gal）显色剂可初步分辨双歧杆菌和其他乳酸菌。益生菌在肠道定殖的前提是人体消化道逆环境有良好的耐受性，不同双歧杆菌的耐受力不同[4-6]。实验分别从健康新生儿粪便和成人粪便筛选出对酸和牛胆盐具有较好耐受性的菌株，进行生理生化、分子生物学鉴定，并探讨其在模拟胃肠道环境中的存活能力，为该菌株的后期功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康新生儿粪便来源于出生19 d的母乳喂养儿童；健康成人粪便来源于24 周岁健康女性。

1.2 培养基及缓冲液

改良MRS培养基[7]（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏5.0、酵母膏4.0、葡萄糖20.0、磷酸氢二钾2.0、乙酸钠5.0、柠檬酸三铵2.0、硫酸镁0.2、硫酸锰0.05，吐温-80 1.0 mL/L。

初筛培养基：在改良MRS培养基中添加20 g/100 mL琼脂和60 mg/mL X-Gal。

复筛培养基：pH 3.0改良MRS培养基；3.0 mg/mL胆盐的改良MRS培养基。

蛋白胨缓冲水溶液（g/L）：蛋白胨10、磷酸氢二钠2、葡萄糖5、磷酸氢二钾2、氯化钠5。

1.3 试剂

人工胃液[8-9]：准确取0.1 g/mL的盐酸16.4 mL，稀释，调节pH值分别达到2.5、3.0、3.5、4.0。分别加入胃蛋白酶终质量浓度为1 g/100 mL，充分溶解后，用孔径0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

人工肠液：称取KH2PO43.4 g，加250 mL蒸馏水溶解，用0.4 g/100 mL NaOH溶液调节至pH 6.8，稀释至500 mL，加入胰蛋白酶终质量浓度为1 g/100 mL，充分溶解后，用孔径0.20 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

1.4 仪器与设备

YQX-Ⅱ厌氧培养箱 浙江义乌冷冻机总厂；YXQLS-50/75SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；显微镜 重庆光学仪器厂；pH计 上海精密科学仪器有限公司。

1.5 方法

1.5.1 双歧杆菌初筛

健康新生儿及成人粪便样品收集后置于无菌离心管中，塞紧并放于装有冰袋的盒子带回，于改良MRS液体培养基富集后，梯度稀释，涂布初筛培养基平板，厌氧培养48 h，挑取蓝色菌落纯化3 次。纯化后的菌株进行厌氧需氧实验，挑取严格厌氧菌30%甘油管保存。

1.5.2 耐酸耐胆盐复筛[10-11]

甘油管保存的菌株接入液体培养基活化20 h后，按1%的接种量接种到pH 3.0的改良MRS培养基或3 mg/mL胆盐的改良MRS培养基中，厌氧培养20 h，紫外分光光度计测定OD600nm值。

1.5.3 形态学及生理生化鉴定

挑取复筛后的菌株进行革兰氏染色，镜检观察菌体颜色、大小、形状等是否符合双歧杆菌属的基本形态特征。挑选革兰氏阳性而且具有双歧杆菌属基本形态特征的菌株进行接触酶实验、明胶液化、吲哚实验、糖发酵实验、F6PPK实验[12]。

1.5.4 分子生物学鉴定[13-14]

利用16S rDNA分子生物学特征鉴定。通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以待测菌基因组为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，PCR反应条件：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性 1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30 个循环；72 ℃后延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。序列的同源性在GenBank数据库中使用BLAST工具进行比较，基于此序列，利用MEGA5.2软件构建系统发育树，确定待测菌的分类地位。

1.5.5 人工胃液耐受性实验[15]

取1 mL活化后的种子液离心收集菌体，弃上清液，将菌泥转到10 mL pH值分别为2.5、3.0、3.5、4.0的人工胃液中，混匀，37 ℃厌氧培养，分别于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后取样，梯度稀释，进行平板计数。

1.5.6 人工肠液耐受性实验[16]

取1 mL活化后的种子液离心收集菌体，弃上清液，将菌泥转到10 mL人工肠液中，混匀，37 ℃厌氧培养，分别于0、1.0、2.0、3.0、4.0 h后取样，梯度稀释，进行平板计数。

1.5.7 耐胆盐实验

在改良MRS液体培养基中加入牛胆盐（3.0 mg/mL），121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。冷却至37 ℃以下备用，将活化后的种子液以1%的接种量接种到上述处理后的培养基中，37 ℃恒温培养24 h后，进行平板计数。

2 结果与分析

2.1 双歧杆菌初筛

图1 菌落形态Fig.1 Colonial morphology

图2 菌株显微镜观察（×1 000）Fig.2 Microscopic observation (× 1 000)

多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶且活性较好，在改良MRS培养基中添加底物X-Gal，半乳糖苷酶水解底物释放出吲哚，双歧杆菌菌落显蓝色，乳酸菌和其他细菌一般为白色或浅蓝色，如图1所示。纯化3 次后，挑取严格厌氧菌进行镜检，如图2所示，双歧杆菌[2]是外观变化很大的杆状体，少许分叉成 Y、V类型，以及棍棒状或匙状类型，初筛得到75 株疑似双歧杆菌。

2.2 耐酸耐胆盐复筛

图3 不同菌株在pH 3.0和3.0 mg/mL胆盐的MRSC作用20 h的生长情况Fig.3 Absorbance values of different strains in pH 3.0 MRSC or MRSC with 3.0 mg/mL bile salt for 20 h

复筛后，获得11 株耐酸耐胆盐较好的菌株，如图3所示，挑取NCU712、NCU701、NCU708进行生理生化鉴定（均来源于健康成人粪便）。

2.3 形态及生理生化鉴定

表1 部分生理生化鉴定结果Table 1 Some physiological and biochemical tests

根据表1、2、GB 4789.34—2012《食品微生物检验 双歧杆菌的鉴定》及伯杰氏细菌鉴定手册第8版，NCU712为基本符合长双歧杆菌的生理生化特征，而NCU701与NCU708不能确定，故将3 株菌进行分子生物学鉴定。

表2 糖发酵实验Table 2 Carbohydrate fermentation tests

2.4 分子生物学鉴定

图4 菌株NCU712的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain NCU712

将菌株的16S rDNA基因序列分析测序结果在GenBank数据库中使用BLAST工具进行比对，NCU701、NCU708、NCU712与长双歧杆菌的同源性均达到98%以上，可确定3 株菌均为双歧杆菌属。且运用专业软件MEGA5.2构建系统发育树，如图4所示，菌株NCU712与长双歧杆菌属于同一个分支，16S rDNA序列分析结果显示与长双歧杆菌的同源性最近，为99%。结合菌落形态、镜检观察及生理生化实验，鉴定菌株NCU712为长双歧杆菌。

2.5 人工胃液耐受性

双歧杆菌作为一种重要的益生菌，必须进入人体的胃肠道逆环境且达到一定浓度方可发挥益生功能。食物通过胃的时间一般是1～2.5 h，人体胃液pH值通常在3.0左右，随着饮食变化而波动。这种酸性环境可激活胃蛋白酶原，从而杀灭随食物进入胃内的细菌。故双歧杆菌必须具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。长双歧杆菌NCU712在不同pH值的人工胃液中的活菌数随时间变化如图5所示。

图5 NCU712在不同pH值人工胃液作用不同时间的活菌数Fig.5 Changes in viable NCU712 count during inc ubation in artificial gastric fluid at different pH values

D值[17]表示在特定的环境下，杀灭90%微生物所需要的时间。由图5可知，人工胃液pH 2.5时，D值为30.42 min；人工胃液pH 3.0时，D值为92.97 min。Li Jia等[6]的研究显示4 种双歧杆菌标准菌株在pH 3.0条件下，D值接近1.1 min，与之相比，NCU712耐酸能力强近百倍。且当人工胃液pH 3.5和4.0时，活菌数呈略微上升趋势，可见此人工胃液pH值和胃蛋白酶已基本不影响NCU712的生长。

2.6 人工肠液耐受性

益生菌经胃进入肠道，小肠内存在大量、种类繁多的微生物，肠内环境pH值大约为7.6，含有胰蛋白酶及胆汁酸等对肠内菌群有影响的成分。因此益生菌对肠液必须具有一定耐受性，并保持106CFU/mL以上的活菌数，才能发挥益生作用。食物通过小肠的时间一般为1～4 h，由图6可知，双歧杆菌NCU712在人工肠液中活菌数随作用时间延长而下降，D值为155.32 min，可见菌株NCU712耐胰蛋白酶的能力较强。

图6 NCU712与人工肠液作用不同时间的活菌数Fig.6 Changes in viable NCU712 counts during incubation in artificial intestinal fluid

2.7 耐胆盐实验

肠液分泌的胆汁影响双歧杆菌的存活，胆盐会改变菌体外膜通透性，因此对菌体生长产生抑制作用，甚至杀灭菌体。牛胆汁与人胆汁效力相接近，故常用于模拟人体肠道胆汁。正常人体肠胆汁盐含量在0.3～3.0 mg/mL，汪川等[18]探索了104 株人源性乳酸杆菌对酸和胆盐耐受性，发现80%以上菌株在3.0 mg/mL胆盐中培养4 h后的活菌数下降2（lg（CFU/mL）），且耐酸（pH 3.0）能力普遍强于耐胆盐（3.0 mg/mL）能力。刘吉成等[19]研究了双歧杆菌在不同质量浓度胆盐环境下的活菌数，结果显示在含3.0 mg/mL胆汁盐3 h时的活菌数已下降1（lg（CFU/mL））。Li Jia等[6]的研究显示4 株不同双歧杆菌在3.0 mg/mL胆汁盐中作用20 h后的活菌数下降了3（lg（CFU/mL））以上，其中长双歧杆菌下降4（lg（CFU/mL））。而NCU712在含3.0 mg/mL胆盐的改良MRS培养基作用20 h后，活菌数由4.0×107CFU/mL降到1.0×106CFU/mL，下降了1（lg（CFU/mL）），可见NCU712对胆盐具有一定的耐受性。

3 结 论

双歧杆菌是人体肠道内最重要的益生菌，利用添加X-Gal的改良MRS作为选择性培养基初筛得到75 株疑似双歧杆菌，经复筛、生理生化鉴定及分子生物学鉴定后，确定菌株NCU712为长双歧杆菌。在胃液pH 2.5时，菌株NCU712的D值为30.42 min；胃液pH 3.0时，D值为92.97 min，作用2.5 h活菌数仍有107CFU/mL；胃液pH 3.5和4.0时，活菌数随作用时间的延长而略有上升。NCU712在人工肠液中作用4.0 h后，活菌数仍有108CFU/mL。菌株NCU712在3 mg/mL胆盐的改良MRS培养基中培养24 h后，活菌数下降1（lg（CFU/mL））。可见NCU712对人体胃肠道逆环境耐受性较好。因此长双歧杆菌NCU712具有一定的应用潜力，其生物活性功能及应用于食品的安全性分析还有待于进一步研究。

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Screening of Bifidobacteria with Acquired Excellent Tolerance to Human Gastrointestinal Tract

XIONG Tao, HUANG Qiao-fen, DU Man
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Totally 75 suspected bifidobacterium were obtained in modified MRSC broth with 60 mg/mL X-Gal. Of these strains, 11 with high viability were screened by simulating the micro-environment of the human gastrointestinal tract using MRSC broth (pH 3.0) and then MRSC with 3 mg/mL bile salt for 20 h. Physiological and biochemical tests were conducted on NCU712, NCU701, and NCU708. They were all identified as B. longum via 16S rDNA sequencing. NCU712 was in line with the characteristics of B. longum. Preliminary study on its tolerance to the human digestive environment was conducted. The results showed that the viable count rose slightly with increasing incubation time when the pH of artificial gastric fluid equaled or exceeded 3.5. The death value (the time it takes to kill 90% of cells) of NCU712 was 92.97 min and 30.42 min in artificial gastric fluid at pH 2.5 and pH 3.0, respectively. The number of viable NCU712 cells remained more than 107CFU/mL after 2.5 h. The number of living bacterium remained above 108CFU/mL after 4.0 h in artificial intestinal fluid. The number of viable NCU712 cells was reduced by one order of magnitude after being incubated in MRSC with 3 mg/mL bile salt for 24 h. In summary, B. longum NCU712 has excellent tolerance to the human gastrointestinal tract and may be regarded as functional probiotic with great application potential.

Bifi dobacterium; screening and identification; gastrointestinal tract; tolerance

Q93-3

A

1002-6630（2014）13-0161-05

10.7506/spkx1002-6630-201413031

2013-09-13

国家高技术研究发展计划（863计划）项目（2011AA100904）；国家重点实验室目标导向项目（SKLF-ZZA-201303）；江西省教育厅科技落地计划项目（赣财教[2011]243号）

熊涛（1970—），男，教授，博士，研究方向为益生菌及大宗果蔬高值化利用。E-mail：xiongtao0907@163.com