桑葚多糖调节血糖代谢及体外抗氧化效果研究

王 强，王 睿，王 存，龙 洁

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067；2.重庆第二师范学院教务处，重庆 400067）

桑葚多糖调节血糖代谢及体外抗氧化效果研究

王 强1，王 睿1，王 存1，龙 洁2

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067；2.重庆第二师范学院教务处，重庆 400067）

研究桑葚多糖（mulberry polysaccharides，MBPs）对糖尿病大鼠的降糖效果及体内外抗氧化活性。在体外化学条件下，测定MBPs清除·OH和O2－·能力；采用链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠分别灌胃150、300、450mg/（kg·d）剂量的MBPs。结果表明：MBPs清除·OH和O2－·的EC50分别为0.17、0.54mg/mL；MBPs能显著改善糖尿病大鼠血糖水平、血脂指标（甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇）、脂质过氧化水平（丙二醛）和血清抗氧化状态（谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶及总抗氧化能力）；MBPs具有降血糖作用。

桑葚多糖；糖尿病；血糖代谢；抗氧化

桑葚为桑科落叶乔木桑树（Morus alba L.）的成熟果实，具有较高营养和药用价值，被誉为“民间圣果”；其含有矿物质、维生素、多酚和多糖等生物活性成分，是一种优质的功效成分提取资源[1-4]。国内外研究表明，桑葚具有乌发明目、滋阴补血、润肠通便、补肝益肾、增强免疫、降血压、降血脂和抗衰老等功效[5-8]，这使桑葚作为一种特效营养保健食品备受人们的重视。现代医学和营养学的研究表明桑葚中的活性多糖具有调节机体血糖水平等功能[9]，已成为当前医药和食品领域研究与开发的热点。赵喜兰等[10]研究发现，桑葚多糖中的DEAE-纤维素柱分离中性多糖P-1的降糖效果较高，但未对桑葚多糖的降糖机理进行深入研究。

我国每年利用的桑叶数千吨，但对桑葚资源的利用十分有限[11-12]。若将这些废弃的桑葚作为生产活性多糖的原料，将会产生大量的优质的桑葚多糖（mulberry polysaccharides，MBPs）。本实验研究了MBPs在体外抗氧化实验条件下，MBPs清除·OH和O2－·能力；同时采用链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型，糖尿病大鼠分别灌胃150、300、450mg/（kg·d）剂量的MBPs，探讨其对糖尿病大鼠血糖、血脂的影响，对于桑葚多糖的科学研究、引导桑葚产业发展、指导消费及宣传具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

桑葚：采自于重庆忠县农户桑葚园，经鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的成熟果穗。

链脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美国Sigma-Aldrich公司；其他化学试剂均为国产分析纯；所用水为双蒸水，所用溶液均自行配制。

DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D三孔电热恒温水槽 上海齐欣科学仪器有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；冷冻离心机 美国贝克曼公司；LSC真空冷冻干燥机 德国Martin Christ公司；血糖仪 北京怡成生物电子技术有限公司；生化试剂盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 MBPs的制备

选择新鲜无病虫害、质地油润、肉质致密、色泽鲜艳的成熟桑葚作为原料。将原料清洗，原料干燥（65 ℃，DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱）至水分含量8%；粉碎机粉碎，过60 目筛。用80%的乙醇溶液（液料比为15∶1（V/m））85 ℃热处理两次（2×1 h），以除去单糖、低聚糖和色素等小分子物质，同时灭酶活以防止在提取过程中多糖的降解。抽滤、浓缩、真空冷冻干燥，得到预处理原料（得率87.4%）。预处理后的桑葚干粉于95 ℃热水提取两次（2×2 h，液料比为32∶1（V/m））→离心（1 510×g，10 min）→合并上清液→95%乙醇、100%乙醇和丙酮分别处理，4 ℃放置24 h→离心（1 510×g，10 min）→溶解，Sevag方法脱蛋白[13]（Sevag法脱蛋白10 次）→透析→冷冻干燥→MBPs（多糖的得率7.6%）

1.2.2 体外抗氧化活性的测定

1.2.2.1 清除·OH的测定

参照Wang Hongyuan等[14]方法并略有修改。取0.6 mL邻二氮菲的乙醇溶液（5 mmol/L），加入0.4 mL的磷酸盐缓冲液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.6 mL的FeSO4（0.75 mmol/L），加入待测MBPs 2 mL混匀后，加入0.4 mL的体积分数0.1%H2O2摇匀，37℃条件下水浴60min，在536 nm波长处测其吸光度（Ai）；以去离子水代替MBPs和H2O2溶液重复上述操作，在536 nm波长处测其吸光度（Ac）；以去离子水代替MBPs来重复以上操作，在536 nm波长处测得吸光度（Aj）。按式（1）计算·OH清除率。

1.2.2.2 清除O2－·的测定参照Zhang Tao等[15]的方法，取MBPs 0.1mL，加入0.1mol/L Tris-HCl（pH8.2）缓冲溶液2.8mL混匀，在25 ℃水浴10min后加入3 mmol/L的邻苯三酚溶液（25 ℃水浴预热）0.1 mL，混匀后迅速在320 nm波长处测定吸光度，每隔30 s读取A320nm，5 min后结束；以去离子水0.1 mL和0.1 mol/L的Tris-HC1（pH 8.2）缓冲溶液2.8 mL调零；空白对照管以去离子水代替MBPs。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率v，按式（2）计算O2－·清除率。

1.2.3 桑葚多糖对STZ糖尿病大鼠血糖代谢的调节作用

1.2.3.1 糖尿病动物模型的建立

实验大鼠饲养条件为：温度18～22℃、湿度45%～55%，自然光照，自由采食和饮水。将实验用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（160～200 g）适应喂养1周后，禁食24 h（不禁水），腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（60 mg/kg，溶于0.10 mol/L柠檬酸缓冲液，pH 4.2，现用现配），造模3 d后禁食12 h测空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L即为造模成功。

1.2.3.2 动物分组

正常SD大鼠10 只作正常对照组（NC），将造模成功的糖尿病大鼠50 只按血糖值随机（按血糖值≥11.1mmol/L随机分配）分为5 组：糖尿病模型组（DM）、胰岛素治疗组（IC）、多糖低剂量组、中剂量组和高剂量组（MBPs-L、MBPs-M、MBPs-H）。多糖低、中和高剂量组每天分别一次性灌胃150、300、450 mg/（kg·d）剂量的桑葚多糖水溶液2 mL，正常对照组和糖尿病模型组每天一次性灌胃0.9%生理盐水，胰岛素治疗组每天一次性接受20 units/（kg·d）剂量的胰岛素，实验周期21 d，各组给予基础饲料和自由饮水。

1.2.3.3 测试样品的制备和检测

分别于0、7、14、21 d定时减尾取血，用血糖仪测量各组大鼠空腹血糖；于末次灌胃后禁食12 h，摘眼球取血，收集血液，4 000 r/min离心10 min，上清液备用，所有处理均在4 ℃条件下完成。血清总胆固醇（serum total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）及总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定；蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[16]。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 15数据处理软件，各组数据结果均以±s表示，并进行方差分析，LSD法多重比较，P＜0.05为差异具有显著性，P＜0.01为差异具有极显著性。

2 结果与分析

2.1 MBPs体外抗氧化活性

STZ是自由基激活剂，可直接导致胰岛组织中H2O2和等自由基的增高，从而引起胰岛细胞结构破坏和功能丧失，引起糖代谢紊乱，引发糖尿病[17]。自由基与机体的许多功能障碍和疾病的发生密切相关，由图1、2可知，MBPs对·OH和都有一定的清除作用，且均随MBPs剂量的增加，清除能力逐渐增强。一般用EC50（自由基清除率为50%时的所需样品的质量浓度）对自由基的清除能力进行衡量，其值越小，清除能力就越强。MBPs清除·OH和的EC50分别为0.17 mg/mL和0.54 mg/mL。

图1 MBPs清除OH的能力Fig.1 ·OH scavenging activity of MBPs

图2 2 MBPs清除Ps的能力Fig.2 scavenging activity of MBPs

2.2 MBPs对糖尿病大鼠血糖的影响

图3 各组大鼠的血糖水平Fig.3 Blood glucose concentrations of rats

由图3可知，给药前与正常对照组（NC）相比，各糖尿病模型组大鼠血糖值均维持在较高水平，具有极显著性差异（P＜0.01），说明造模成功的大鼠血糖含量较正常组明显升高。给药21d后，与糖尿病模型组（DM）比较，胰岛素治疗组（IC）和不同剂量多糖组具有极显著性差异（P＜0.01），说明MBPs能抑制或降低大鼠血糖值的升高，其效果与多糖计量成正相关，并且效果比IC组明显。

2.3 MBPs对各组大鼠血脂的影响

图4 不同剂量的MBPs对STZ诱导糖尿病大鼠血清的TG（A）、TC（B）、LDL-C（C）和HDL-C（DD）影响Fig.4 Effects of different levels of MBPs on TG (A), TC (B), LDL-C (C), and HDL-C (D) levels in STZ-induced diabetic rats

由图4可知，模型对照组大鼠血清中血脂4项，即TG、TC、LDL-C和HDL-C与正常对照组相比差异显著（P＜0.05）。MBPs低、中、高剂量组大鼠血清TG、TC和LDLC水平均低于模型对照组，HDL-C水平均高于模型对照组， 差异显著（P＜0.05）。随着剂量的增加，STZ糖尿病大鼠血清TG、TC和LDL-C水平呈下降趋势，而HDL-C水平呈上升趋势。说明MBPs对STZ糖尿病大鼠的血脂指标具明显的调节作用。并且MBPs高剂量组各血脂指标与正常对照组相比无显著差异，表明高剂量组可有效降低STZ糖尿病大鼠血脂。

2.4 MBPs对脂质过氧化水平和血清抗氧化状态的影响

图5 不同剂量的MBPs对STZ诱导糖尿病大鼠血清的SOD（A）、MDA（B）、GSH-Px（C）、T-AOC（D）水平的影响Fig.5 Effects of different levels of MBPs on SOD (A), MDA (B), GSH-Px (C), and T-AOC (D) levels in STZ-induced diabetic rats

由图5A可知，与糖尿病模型组相比，MBPs低、中和高剂量组的血清SOD活性显著提高（P＜0.05），MBPs高剂量组的血清SOD活性与正常对照组相比没有显著差异，MBPs高剂量组对SOD活性增强效果优于胰岛素治疗组。由图5B可知，MBPs低、中和高剂量组与糖尿病模型组相比，血清MDA含量分别降低了17.4%、27.5%和36.2%，差异显著（P＜.05），并且MBPs高剂量组对MDA含量的降低效果与正常对照组相比没有显著差异。由图5C可知，与糖尿病模型组相比，MBPs低、中和高剂量组的血清GSH-Px活性显著提高（P＜0.05），MBPs高剂量组的血清GSH-Px活性与正常对照组相比没有显著差异，MBPs高剂量组对GSH-Px活性增强效果优于胰岛素治疗组。由图5D可知，MBPs低、中、高剂量组大鼠血清T-AOC水平均显著高于模型对照组（P＜0.05），随着剂量的增加，STZ糖尿病大鼠血清T-AOC水平呈上升趋势。结果说明MBPs对STZ糖尿病大鼠的脂质过氧化水平和血清抗氧化状态具明显的调节作用。

3 结 论

3.1 MBPs对·OH和O2－·有一定的清除活性，且MBPs清除自由基活性与其质量浓度呈正比。

3.2 实验研究了不同剂量的MBPs对STZ诱导糖尿病大鼠血糖水平、血脂指标、脂质过氧化水平和血清抗氧化状态的影响，结果发现，MBPs能显著降低STZ诱导糖尿病大鼠血糖水平，增强糖尿病大鼠血清SOD和GSH-Px活性，增加大鼠血清T-AOC含量，降低其血清MDA含量。同时MBPs治疗组与模型组比较，TG、TC、LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高。MBPs有较好的防治糖尿病的作用，并且其作用优于短效胰岛素。MBPs具有降血糖作用，这为MBPs有可能成为新的天然降糖药物或保健品提供了科学依据。

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Effects of Mulberry Polysaccharides on Glucose Metabolism and Their Antioxidant Activities in vitro

WANG Qiang1, WANG Rui1, WANG Cun1, LONG Jie2
(1.Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 2. Academic Administration of Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

The purpose of this study was to investigate the hypoglycemic activity of polysaccharides isolated from mulberry (MBPs) on streptozotocin-induced diabetes in rats and their antioxidant activity in vitro. Their scavenging activities for hydroxyl and superoxide anion radicals in vitro were determined. The results showed that the EC50values of MBPs for hydroxyl and superoxide anion radical scavenging were 0.17 and 0.54 mg/mL, respectively. MBPs had a significant improvement on blood glucose levels, serum lipid parameters (triglyceride, total cholesterol, low density lipoproteincholesterol (LDL-C), high density lipoprotein-cholesterol (HDL-C)), lipid peroxidation (malondiadehyde content) and serum antioxidant status (glutathione-peroxidase (GSH-Px), superoxide dismutase (SOD), total antioxidant capacity (T-AOC)) in diabetic rats. This study may provide experimental evidence for the development of antihyperglycemic agent from mulberry polysaccharides.

mulberry polysaccharides; diabetes; glucose metabolism; antioxidant activity

TS201.2

A

1002-6630（2014）11-0260-05

10.7506/spkx1002-6630-201411052

2013-06-30

重庆高校创新团队建设计划资助项目（KJTD201325）

王强（1982—），男，副教授，硕士，研究方向为抗氧化自然资源利用与生理生化。E-mail：gogo1443@sina.com