高良姜多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

郑 义，王卫东，李 勇，朱园园，郭 静

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221000；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221000）

高良姜多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

郑 义1,2，王卫东1,2，李 勇1,2，朱园园1，郭 静1

（1.徐州工程学院食品（生物）工程学院，江苏 徐州 221000；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221000）

通过Box-Behnken试验设计，获得了热水浸提高良姜多糖的最佳工艺；以清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力、还原力、清除羟自由基能力、螯合铁离子能力为指标，评价了高良姜多糖的抗氧化活性。结果表明，热水浸提高良姜多糖的最佳工艺条件为液料比43∶1（mL/g）、浸提温度95 ℃、浸提时间3 h，在此条件下多糖得率实测值为11.81%。高良姜多糖具有较好的抗氧化活性，清除自由基能力、还原力和螯合铁离子能力均表现出一定的质量浓度依赖性；高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羟自由基和螯合铁离子能力的半数有效质量浓度（EC50）分别为（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。

高良姜；多糖；响应面法；抗氧化活性

高良姜为姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根茎，别名风姜、小良姜、高凉姜、良姜等，为卫生部认定的药食同源的物品之一。高良姜营养成分丰富，含有丰富的糖类、蛋白质、微量元素等。目前国内外对高良姜的研究主要集中于黄酮[1-3]、芳香油[4-5]等化学成分及抑菌、抗肿瘤、降血脂等药理功能上[6-9]，有关高良姜多糖的研究极少，而关于春砂仁、莪术等其他姜科植物多糖的研究较多，并发现多种姜科植物多糖具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等作用[10-11]。目前有关高良姜多糖的提取工艺及抗氧化性能尚未见报道。本研究采用热水浸提法提取高良姜多糖，并基于响应面法对提取工艺进行优化，评价高良姜多糖的抗氧化活性，旨在为高良姜资源的开发利用提供科学依据和理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜高良姜产地为广东徐闻，品种为牛姜，5年生；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、菲咯嗪（ferrozine） 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；THZ-82恒温振荡器 常州国华电器有限公司；R201L旋转蒸发器 上海申生科技有限公司；LGJ-10冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂；3K30高速冷冻离心机 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 高良姜多糖的提取

将新鲜高良姜用清水洗净，去皮，适当切片，60 ℃干燥，恒质量后粉碎，过60目筛，干燥保存待用。称取一定量的高良姜干粉，加适量水，恒温振荡器中提取一定时间，抽滤后得多糖提取液。多糖提取液进行浓缩、4 ℃醇析、离心，所得沉淀用无水乙醇洗涤3次，沉淀晾干。Sevag法脱蛋白，反复进行5次。自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h。透析液浓缩后冷冻干燥得高良姜多糖。称取一定量高良姜多糖，用蒸馏水配制成20 g/L母液，4 ℃保存，备用。

1.3.2 多糖含量测定

多糖含量测定采用苯酚-硫酸法[12]。

多糖得率Y/%=高良姜多糖质量/高良姜干粉质量×100 1.3.3 单因素试验

设定液料比20∶1（mL/g）、浸提温度90 ℃、浸提时间2 h，固定其他因素，分别考察液料比、浸提温度和时间对多糖得率的影响。每组试验重复3次，取其平均值。1.3.4 Box-Behnken试验设计

在单因素试验的基础上，采取Box-Behnken试验设计安排三因素三水平试验，试验因素水平表如表1所示。每组试验重复3次，取其平均值。

表1 Box-Behnken试验因素水平表Table1 Coded levels for factors used in Box-Behnken experimental design

1.3.5 抗氧化活性测定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率测定

DPPH自由基清除率测定参考Wu Huichun等[13]的方法，取不同质量浓度（0.3～10 g/L）的高良姜多糖，在517 nm波长处检测吸光度。以VC作为阳性对照。清除率计算公式如下：

式中：Ac为1.5 mL蒸馏水加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Ai为1.5 mL样品液加1.5 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液的吸光度；Aj为1.5 mL样品液加1.5 mL 95%乙醇溶液的吸光度。

1.3.5.2 还原力测定

还原力测定方法采用铁氰化钾法[14]。量取不同质量浓度（0.05～1.5 g/L）的样液2 mL，加入2 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.6）和质量分数1%的铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴下保温20 min，再加入2 mL质量分数10%三氯乙酸溶液，混匀，3 000 r/min离心10 min。取上清液2 mL，加入2 mL去离子水和0.4 mL质量分数0.1%的FeCl3溶液，混匀后在50 ℃水浴下保温10 min，当体系溶液颜色由黄色变为蓝色时，在700 nm波长处测定其吸光度A700nm。以去离子水代替样品作为空白对照，VC作为阳性对照。

1.3.5.3 羟自由基清除率测定

羟自由基清除率测定采用邻二氮菲比色法[15]。样品溶液质量浓度为0.01～2 g/L，以VC作为阳性对照。

损伤管：取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液加入1 mL磷酸盐缓冲液（0.15 mol/L，pH 7.40）和0.5 mL去离子水，混匀后加入0.5 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，混匀后再加入0.5 mL体积分数0.01%的H2O2，37 ℃水浴60 min后，536 nm波长处测其吸光度为A损。

未损伤管：以0.5 mL去离子水代替损伤管中的H2O2，重复上述操作步骤，测其吸光度为A未损。

样品管：0.5 mL样品溶液代替损伤管中的去离子水，测其吸光度为A样。

样品参比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.40）和0.5 mL样品溶液混合，加入1.5 mL去离子水，不需水浴，测其吸光度为A参。

空白参比：取1 mL 0.15 mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 7.40）加入2 mL去离子水，作为空白调零A空。

清除率计算公式为：

1.3.5.4 铁离子螯合能力测定

铁离子鳌合能力的测定采用 Decker等[16]的方法，略有改动。在2 mL不同质量浓度（0.5～10 g/L）的样品溶液中，加入0.02 mL 5 mmol/L的FeCl2溶液，再加0.2 mL 5 mmol/L菲咯嗪，室温静置10 min，加入等体积的蒸馏水，摇匀，于562 nm波长处测量吸光度。上述反应体系中，以蒸馏水替代样品溶液作为空白对照，乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）作为阳性对照。每个样品平行测定3次，取其平均值。铁离子鳌合能力计算公式如下：

铁离子螯合率/%=（A0－A1）/A0×100

式中：A0和A1分别为为空白对照和样品或阳性对照的吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对多糖得率的影响

图1 液料比对多糖得率的影响Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

由图1可知，多糖得率随液料比的增大而增加，液料比达到40∶1（mL/g）后，多糖得率增加缓慢，表明此时浸提过程已达到基本稳定。液料比过大，后续浓缩时耗能加大，从降低成本、节约能源角度考虑，液料比宜在40∶1（mL/g）左右。

2.1.2 浸提温度对多糖得率的影响

图2 浸提温度对多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature time on the yield of polysaccharides

由图2可知，温度在60～90 ℃之间，多糖得率随着浸提温度的升高而增加，温度从90 ℃升高到100 ℃，多糖得率变化不大，故选择较优浸提温度为90 ℃。

2.1.3 浸提时间对多糖得率的影响

图3 浸提时间对多糖得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

由图3可知，多糖得率在1.5～3.0 h时间内呈显著增加的趋势，浸提时间超过3.0 h后，多糖得率增幅趋于平缓，此时多糖已基本浸提完全，故选择3.0 h为浸提时间较优值。

2.2 Box-Behnken试验

Box-Behnken试验设计与结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table2 Design and results of experiments

2.2.1 回归模型的建立与检验

对表1试验数据用多元回归拟合后，得到多糖得率Y与液料比x1、浸提温度x2和浸提时间x3的回归方程：

对该回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归模型方差分析Table3 Analysis of variance for the regression model

该模型达到极显著水平（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），决定系数R2为0. 974，校正决定系数为0.942，信噪比RSN为14.79，可知该回归方程拟合度和可信度均很高，故可用于设计范围内的预测。

对表3回归模型系数的显著性分析可见，一次项中，x2、x3极显著，x1达到显著水平（P＜0.05）；平方项的回归系数均极显著，说明各因素与多糖得率之间存在明显的二次关系；交互项中x2x3的回归系数达到极显著水平，表明浸提温度与浸提时间的交互作用对多糖得率有显著影响。

2.2.2 两因素间的交互效应分析

由表3可知，浸提温度与浸提时间的交互作用对多糖得率有显著影响，固定液料比于零水平，绘出浸提温度与浸提时间的响应面，如图4所示。随着浸提温度的升高与浸提时间的延长，多糖得率呈现出先急剧增加后缓慢下降的趋势。当浸提温度在90～100 ℃，浸提时间在2.9～3.3 h时，多糖得率较高。

图4 浸提温度与浸提时间的交互效应对多糖得率的影响Fig.4 Interactive effect of extraction temperature and extraction time on the yield of polysaccharides

2.2.3 最佳条件优化及验证结果

通过所得回归模型对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺条件为液料比42.75∶1（mL/g）、浸提温度94.95 ℃、浸提时间3.06 h，在此条件下高良姜多糖得率的理论得率为11.73%。考虑实际操作情况，将最佳提取工艺修正为液料比43∶1（mL/g）、浸提温度95 ℃、浸提时间3 h。在此修正条件下，实测提取率为11.81%，表明该回归模型具有较好的预测性能，对于指导生产实践具有一定的借鉴意义。

2.3 高良姜多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基能力

图5 高良姜多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.5 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against DPPH radicals

由图5可知，在测定的质量浓度范围，高良姜多糖对DPPH自由基的清除能力呈现出剂量依赖性。质量浓度为0.1 g/L时，清除率为22.14%，质量浓度为1 g/L时，清除率为66.69%，质量浓度为5 g/L时，清除率达到了98.36%。当质量浓度低于3 g/L时，高良姜多糖对DPPH自由基的清除能力均低于阳性对照VC；而当质量浓度为5 g/L时，高良姜多糖的清除率高于VC。

半数有效浓度（median effective concentration，EC50）是指清除率为50%时的样品质量浓度，EC50可作为评价抗氧化能力的重要参数。如某种物质的EC50低于10 g/L，则表明其具有很好的抗氧化活性[17]。采用Logit回归计算出高良姜多糖及VC的EC50分别为（0.59±0.01）、（0.09±0.001） g/L。高良姜多糖清除DPPH自由基的EC50远小于10 g/L，由此可见高良姜多糖具有明显清除DPPH自由基的能力。

有关植物多糖清除DPPH自由基能力已有较多研究，李娇等[18]报道了芦笋多糖的EC50为（1.50±0.75）g/L；葛霞等[19]用D301R型大孔树脂纯化制备青钱柳多糖，在质量浓度为4 g/L时，青钱柳多糖对DPPH自由基的清除率为71.8%。由此可见，高良姜多糖对DPPH自由基的清除能力明显高于芦笋多糖、青钱柳多糖等植物多糖。

2.3.2 还原力

图6 高良姜多糖的还原力Fig.6 Reducing power of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

由图6可知，在0.05～1.5 g/L的质量浓度范围内，高良姜多糖的还原力随着质量浓度的增加而增加，当质量浓度为0.1 g/L时，吸光度为0.285；当质量浓度为1.5 g/L时，吸光度则达到了1.027。对于分光光度法而言，吸光度高于1.0时，测量结果的相对误差较大，故不再进一步加大高良姜多糖质量浓度。在已测量的质量浓度范围内，高良姜多糖的还原力不及VC。

马虎飞等[20]报道了质量浓度为1 g/L的陕北野生枸杞多糖的还原力为0.493；Wang Junlong等[21]通过微波辅助提取获得了圆头蒿多糖，并对其抗氧化活性进行评价，在质量浓度为5 g/L时，圆头蒿多糖的还原力为0.86。与上述植物多糖相比，高良姜多糖表现出更强的还原力。

2.3.3 清除羟自由基能力

高良姜多糖对羟自由基的清除作用如图7所示，在0.01～2.0 g/L的质量浓度范围内，高良姜多糖对羟自由基的清除能力随质量浓度增大而增大，质量浓度为0.05 g/L时，清除率为50.42%，质量浓度为1 g/L时，清除率为79.78%，在上述质量浓度时，阳性对照VC的清除率分别为53.90%和74.07%，在测定的质量浓度范围内，高良姜多糖清除羟自由基的能力与VC基本相当。采用Logit回归计算出高良姜多糖及VC的EC50分别为（0.05±0.003）、（0.04±0.002）g/L，EC50也表明高良姜多糖与VC清除羟自由基的能力基本相当。

图7 高良姜多糖对羟自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance against hydroxyl radicals

Fu Jianfang等[22]评价了刺五加多糖的抗氧化活性，当质量浓度为0.8 g/L时，刺五加多糖对羟自由基的清除率稍低于60%。钟文武等[23]采用水提醇沉的方法对两种不同寄主的扁枝槲寄生多糖进行提取，两种多糖清除羟自由基的EC50分别为0.541 1、0.590 2 g/L。由此可见，与刺五加多糖和扁枝槲寄生多糖相比，高良姜多糖具有更强的清除羟自由基能力。

2.3.4 铁离子螯合能力

图8 高良姜多糖对铁离子的螯合作用Fig.8 Iron-chelating ability of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

在质量浓度为0.5～10 g/L的范围内，高良姜多糖对铁离子的螯合能力呈现出剂量依赖性。质量浓度为3、5、10 g/L时，螯合率分别为52.53%、78.06%、96.48%。阳性对照EDTA在质量浓度为1 g/L时，螯合率已达到86.92%。高良姜多糖与EDTA对铁离子螯合能力的EC50分别为（2.75±0.2）、（0.12±0.02） g/L。

Chen Huoliang等[24]采用DEAE-纤维素离子交换层析和Sepharose CL-6B凝胶过滤层析法分离纯化得到3个香菇多糖组分LEPA1、LEPB1和LEPC1，在质量浓度为4 g/L时，LEPB1和LEPC1的对铁离子的螯合率分别为99.1%和99.2%。魏磊等[25]评价了鸡油菌、变绿红菇、蜜环菌和棕灰口蘑4种食用菌粗多糖的抗氧化活性，结果显示4种食用菌粗多糖的铁离子鳌合能力的EC50大小的顺序为：棕灰口蘑（1.69 g/L）＜鸡油菌（3.22 g/L）＜蜜环菌（3.41 g/L）＜变绿红菇（3.49 g/L）。高良姜多糖对铁离子的螯合能力弱于香菇多糖和棕灰口蘑，而强于鸡油菌、蜜环菌等，显示出良好的铁离子螯合能力。

3 结 论

本研究建立了热水浸提高良姜多糖的最佳工艺条件，即液料比43∶1（mL/g）、浸提温度95 ℃、浸提时间3 h，在此条件下多糖得率理论值为11.73%，验证值为11.81%。表明该模型具有较好的预测性能，对于指导生产实践具有一定借鉴意义。

在测定的质量浓度范围，高良姜多糖清除DPPH自由基能力、还原力、清除羟自由基能力、螯合铁离子能力均随质量浓度增大而增大。高良姜多糖清除DPPH自由基、清除羟自由基和螯合铁离子能力的EC50分别为（0.59±0.01）、（0.05±0.003）g/L和（2.75±0.2）g/L。高良姜多糖表现出较好的抗氧化活性，可作为潜在天然抗氧化剂应用于食品和保健品工业中，而有关高良姜多糖的结构鉴定及抗氧化活性机理有待进一步研究。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Activities of Polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance

ZHENG Yi1,2, WANG Wei-dong1,2, LI Yong1,2, ZHU Yuan-yuan1, GUO Jing1
(1. College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221000, China; 2. Jiangsu Key Construction Laboratory of Food Resource Development and Quality Safe, Xuzhou 221000, China)

The conditions for hot water extraction of polysaccharides from Alpinia offi cinarum Hance were optimized by Box-Behnken statistical design. The antioxidant activities of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance were investigated using four different in vitro antioxidant assays, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, reducing power, hydroxyl radical scavenging activity and iron-chelating ability. The results showed that the optimal extraction conditions were found to be extraction at 95 ℃ for 3 h with a solvent-to-solid ratio of 43:1 (mL/g). The experimentally observed yield of polysaccharides extracted from Alpinia officinarum Hance was 11.81% under these conditions. The extracted polysaccharides had powerful antioxidant activities for free radical scavenging activity, reducing power and ironchelating capacity in concentration-dependent manner, with median effective concentration (EC50) of (0.59 ± 0.01), (0.05 ± 0.003) and (2.75 ± 0.2) g/L, respectively.

Alpinia offi cinarum Hance; polysaccharides; response surface methodology; antioxidant activity

R284.2

A

1002-6630（2014）02-0126-06

10.7506/spkx1002-6630-201402023

2013-04-28

苏北科技发展计划项目（BC2011401）

郑义（1982—），男，讲师，硕士，研究方向为天然产物与食品生物技术。E-mail：biozheng@gmail.com