蓝莓花青素的提取工艺及其免疫调节活性

潘利华，王建飞，叶兴乾，罗建平,*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

蓝莓花青素的提取工艺及其免疫调节活性

潘利华1,2，王建飞1，叶兴乾2，罗建平1,*

（1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

采用单因素试验和五元二次正交旋转组合设计试验优化蓝莓花青素的提取工艺，并通过体外细胞培养评价蓝莓花青素对脾细胞增殖活力以及协同ConA促进小鼠脾细胞分泌干扰素-α和白细胞介素-2的活性。结果表明：乙醇体积分数、料液比、提取温度和提取时间对蓝莓花青素提取率有显著影响；蓝莓花青素最佳提取工艺条件为：酒石酸为酸化剂、乙醇体积分数74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提温度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提时间144.8～148.5 min，此工艺条件下蓝莓花青素的提取率均大于35 mg/g，具有促进小鼠脾细胞增殖和协同ConA促进小鼠脾细胞分泌干扰素-α和白细胞介素-2活性，且呈一定的剂量相关性。

蓝莓；花青素；正交旋转组合设计；免疫调节活性

蓝莓是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.）多年生常绿灌木果树，原产于加拿大东部和美国东北部[1]。经过100多年的栽培驯化，蓝莓已成为一个世界性的果树新产业，在中国、蒙古北部、前苏联、欧洲、北美等国家和地区均有分布[2]。蓝莓果实中富含的花青素，具有增强机体免疫力、抗氧化、促进视红素再合成、抗心血管疾病、抗衰老等多种生理活性功能，在食品、化妆品、药品等领域有着广阔的应用前景[3-7]。

提取是蓝莓花青素功能产品研发与应用的关键步骤之一[8]。溶剂萃取法是提取花青素的传统方法，这是由于花青素主要以花青素糖苷形式存在于自然界中，具有较强的极性[9-10]。常用的溶剂主要有甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂，石油醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂和水。为提高花青素的溶出率，通常在提取剂中加少量的盐酸、磷酸等无机酸或醋酸、柠檬酸等有机酸[11-12]。但是Revilla等[13]研究表明，当提取液中盐酸浓度高于0.12 mol/L时，会造成红葡萄花青素发生部分水解。所以，为了既能提高花青素的溶出率，又能最大程度地保持其稳定，人们开始采用有机酸酸化的有机溶剂提取花青素。本实验在评价有机酸和无机酸对蓝莓花青素提取效果影响的基础上，对有机酸酸化乙醇的蓝莓花青素提取工艺参数进行了优化，并评价了提取产品蓝莓花青素的免疫调节活性，旨在为蓝莓花青素深加工产品的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓果（兔眼蓝莓巴尔德温栽培种果实） 安徽徽王食品有限公司；雄性BALB/c小鼠（8～10周，体质量（20±2）g） 安徽医科大学动物实验中心；小鼠酶联免疫吸附测定干扰素-α（interferon-α，FN-α）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）试剂盒 南京建成科技有限公司；RPMI-1640培养基 默赛飞世尔科技有限公司；矢车菊素3-O-葡萄糖苷标准品 美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CT15RT型高速冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；Hei-VAP Advantage型旋转蒸发仪 德国Heidolph公司；V1100型可见光分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；LGJ-18S型原位真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州净化设备有限公司；MCO-17AIC型CO2细胞培养箱 日本三洋公司；Model 680型酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓花青素的提取

首先用组织捣碎机将蓝莓鲜果捣碎成蓝莓糊，再置于提取瓶中，加入一定量的酸化乙醇浸提液，然后在一定温度条件下浸提一定时间，得到浸提液；将浸提液在10 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min，取上清液后测定其花青素含量。

1.3.2 单因素试验

精确称取蓝莓鲜果500 g，捣碎成蓝莓糊，加入一定体积的浸提液。设定乙醇体积分数65%、料液比（冷冻鲜果质量与提取剂体积之比）1∶4、浸提温度50 ℃、浸提液pH 4.0、浸提时间60 min，固定其他条件，分别探讨酸化剂、浸提液中乙醇体积分数、浸提料液比、浸提温度、浸提液pH值、浸提时间对蓝莓花青素提取率的影响。

1.3.3 二次正交旋转组合设计试验

在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数、浸提料液比、浸提温度、浸提液pH值、浸提时间共5个因素为研究对象，按照五因素四水平（1/2）实施二次正交旋转组合设计试验，因素水平编码表如表1所示[14]。

表1 二次正交旋转组合试验因素编码水平表Table1 Coded levels for independent variables used in orthogonal rotation combination design

1.3.4 蓝莓花青素的提取率测定

采用双波长pH值示差法[15]，以矢车菊素3-O-葡萄糖苷为参照。取待测液1 mL，加入NaAc-HAc缓冲溶液（pH 4.5，0.4 mol/L）或KCl-HCl缓冲溶液（pH 1.0，0.25 mol/L）9 mL，摇匀，转入光路长为1 cm的比色皿中，以蒸馏水代替样品溶液做空白对照，分别在510 nm和700 nm波长处测定光密度(optical density，OD)。

花青素提取率/（mg/g）=A×Mw×DF×100/（ε×1）

式中：A=（OD510nm，pH1.0－OD700nm，pH1.0）－（OD510nm，pH4.5－OD700nm，pH4.5；Mw=449.2 g/mol，矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量；DF为待测液稀释倍数；ε=26 900 L/（mol·cm），矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数。

1.3.5 蓝莓花青素的免疫调节活性评价

取1.3.1节蓝莓花青素的提取中得到的上清液，通过AB-8大孔吸附树脂吸附，再用体积分数60%的乙醇解吸，收集解吸液；解吸液冷冻干燥得到花青素干粉，根据试验需要配制花青素溶液。

颈锥脱臼法处死小鼠，制备脾细胞悬液并调整其细胞浓度为1×108cells/L。取96孔培养板，每孔先加脾细胞悬液100 øL，空白对照组再加入100 øL RPMI-1640培养基；阳性对照组再加入50 øL RPMI-1640培养基和50 øL ConA（Concanavalin A）溶液（ConA用RPMI-1640培养基配制，终质量浓度为2.5 mg/L，下同）；样品组再分别加入50 øL花青素溶液（花青素用RPMI-1640培养基配制，终质量浓度分别为25、50、100 mg/L）和50 øL ConA溶液（ConA终质量浓度为2.5 mg/L）；每组3孔，每孔终体积200 øL。将培养板置于37 ℃含5% CO2细胞培养箱中培养3 d。取样检测前4 h向每孔中加入50 øL的噻唑蓝，继续培养4 h后3 000 r/min离心10 min，收集上清，按IFN-α、IL-2测定试剂盒标准操作程序于酶标仪上测定IFN-α和IL-2含量。离心管底部的蓝色沉淀用100 øL的二甲基亚砜充分振荡溶解后于酶标仪570 nm波长处测定OD，以OD值表示脾细胞增殖活性[16-17]。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 酸化剂对蓝莓花青素提取率的影响

图1 酸化剂对提取率的影响Fig.1 Effect of acidulants on the extraction efficiency of anthocyanins

由图1表明，与对照组相比，有机酸和无机酸都提高了蓝莓花青素的提取率，酸化剂处理组提取率为对照组的1.1～1.5倍，且以有机酸酒石酸或无机酸盐酸为酸化剂时，蓝莓花青素的提取率最高，分别为33.54 mg/g和32.82 mg/g。盐酸和酒石酸为酸化剂时，蓝莓花青素提取率无显著差异（P＞0.05），但盐酸的腐蚀性明显强于酒石酸，且盐酸易造成花青素的降解[13]。因此，本实验以酒石酸酸化的乙醇作为提取剂。

2.1.2 提取剂中乙醇体积分数对蓝莓花青素提取率的影响

图2 乙醇体积分数对花青素提取率的影响Fig.2 Effect of exthanol concentration on the extraction efficiency of anthocyanins

由图2可见，以酒石酸酸化的乙醇为提取剂，固定其他因素不变，当乙醇体积分数为25%～65%之间时，提取率随着提取剂中乙醇体积分数的增大不断增高；乙醇体积分数为65%时，蓝莓花青素提取率达到最大值33.26 mg/g；但是，随着乙醇体积分数的继续增大，蓝莓花青素提取率反而降低。蓝莓花青素属于黄酮类物质，由花青素苷元与花青素糖苷组成，可溶于水、乙醇等极性溶剂，当提取剂的极性和花青素极性相近时，花青素在提取剂中的溶解性最好，溶出率最大；但当乙醇提取分数继续增大时，提取剂极性相对变小，偏离了蓝莓花青素的极性，从而降低了花青素的溶出，因此，提取率反而有所下降[12,18]。可见，提取剂中乙醇体积分数为65%时，其极性最相近花青素的极性，有利于蓝莓花青素的溶出。

2.1.3 料 液比对蓝莓花青素提取率的影响

图3 料液比对花青素提取率的影响Fig.3 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of anthocyanins

由图3可知，固定其他因素不变，当料液比在1∶2～1∶6（g/mL）时，蓝莓花青素提取率随着液料比的增加而提高，这是由于提取液使用量的增加有利于蓝莓中花青素的溶出。继续增加料液比，蓝莓花青素的提取率并没有继续增加，可能与蓝莓果为小浆果，本身含水率高，1∶6（g/mL）的料液比已经使蓝莓花青素的溶出基本达到饱和有关[19]。

2.1.4 浸提温度对蓝莓花青素提取率的影响

图4 浸提温度对花青素提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of anthocyanins

由图4可知，固定其他因素不变，温度较低时，蓝莓花青素的提取率随着浸提温度的升高而增大。当浸提温度为50 ℃时，提取率最大；继续升高浸提温度，蓝莓花青素提取率反而下降，这可能与花青素的热稳定性较差有关[19-20]。

2.1.5 浸提液pH值对蓝莓花青素提取率的影响

自然条件下，蓝莓花青素为花青素糖苷类物质，在酸性条件下稳定并且呈色效果好[19]。实验结果显示，固定其他因素不变，当浸提液pH值为1～3时，蓝莓花青素提取率稍有提高（数据未显示），但是，为了调整浸提液pH值小于3，势必加入较多的酒石酸，100 mL 60%乙醇溶液调节pH值至2.5时，需加入酒石酸5～6 mL。因此，本研究采用浸提液pH值大于3的酸性条件进行提取。从图6可以看出，当浸提液pH值为3～7时，蓝莓花青素提取率随着pH值的增大而降低。

图5 浸提液pH值对提取率的影响Fig.5 Effect of solvent pH on the extraction efficiency of anthocyanins

2.1.6 浸提时间对蓝莓花青素提取率的影响

图6 浸提时间对提取率的影响Fig.6 Effect of extraction time on the extraction efficiency of anthocyanins

从图6可见，固定其他因素不变，当浸提时间在20～40 min时，蓝莓花青素提取率随着提取时间的延长迅速提高；浸提时间继续延长至150 min时，花青素提取率缓慢增大；继续延长浸提时间，花青素提取率稍有降低。这是因为，随着浸提时间的延长蓝莓花青素不断地溶出，当花青素溶解度接近饱和时，提取率缓慢增加；而花青素的稳定性较差，继续延长浸提时间，提取率反而稍有下降。

2.2 二次正交旋转组合设计试验

2.2.1 二次正交旋转试验结果

五元二次正交旋转组合设计（1/2实施）的试验结果见表2。

表2 二次正交旋转组合设计试验方案及结果Table2 Scheme and results of orthogonal rotation combination design

续表2

2.2.2 回归方程的建立与检验

表3 方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results

采用DPS数据处理系统对表2中的结果进行二次多项式逐步回归分析，得到蓝莓花青素提取效率（Y）和乙醇体积分数（X1）、料液比（X2）、浸提温度（X3）、浸提液pH值（X4）、浸提时间（X5）因子之间的回归方程：

回归方程的的失拟性检验F1＝2.085＜F0.05（6,9）＝3.37及F0.01（6,9）＝5.80，F2＝23.704＞F0.05（20,15）＝2.33及F0.01（20,15）＝3.36（表3），说明模型的预测准确，模型拟合结果好，可用于描述蓝莓花青素提取率随上述5个因素的变化趋势。在α＝0.05显著水平上剔除不显著项后，简化的回归方程：

2.2.3 主效应分析

各因素的P值大小反映了各因素对试验指标的影响强度，P值越小，表明该因素对试验结果影响越大。由表3可知，乙醇体积分数、料液比、浸提温度、浸提时间对蓝莓花青素提取率都有极显著影响，而浸提液pH值有显著影响。

2.2.4 单因素效应分析

将得到的回归方程（1）中的5个因素任意4个固定在零水平，得以下方程式：

图7 各单因素水平值与花青素提取率的关系Fig.7 Relationship between each variable and the extraction efficiency of anthocyanidin

将5个因子的取值固定在－2、－1.5、－0.5、0、0.5、1.0、1.5、2水平，根据方程式（3）～（7），计算出各因子在8个不同水平上花青素提取效率（Y），结果见图7。由图7可知，当各因子处于－2～2区间时，蓝莓花青素提取率随着乙醇体积分数、料液比及浸提时间的增大先升高后趋于平稳，而随着浸提温度和浸提液pH值的增大先增加后下降。这与前面单因素试验结果基本相符。

2.2.5 提取工艺参数的优化

蓝莓花青素提取率大于35 mg/g的572个方案中各变量取值的频率分布分析见表4。由表4可知，蓝莓花青素最佳提取工艺参数范围为：乙醇体积分数74.6%～76.2%，料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL），浸提温度52.5～53.4 ℃，浸提液pH 3.0～3.1，浸提时间144.8～148.5 min。

表4 各变量取值频率分布Table4 Probability distribution of each variable

2.2.6 验证实验

从表4优化的参数取值范围内随机选择3个组合进行验证实验，3次验证实验平均理论值为41.73 mg/g，平均实际值为42.08 mg/g，实际值与理论值基本吻合，且均在35 mg/g以上。由此可知，采用本实验的提取工艺参数，可获得35 mg/g以上的蓝莓花青素提取率。

2.3 蓝莓花青素的免疫调节活性

蓝莓花青素的免疫调节活性以其对小鼠脾细胞 增殖活性的大小以及其联合ConA促进脾细胞分泌IFN-α和IL-2的水平表征。由图8可知，阳性对照组和蓝莓花青素样品组的OD值均大于空白对照组；蓝莓花青素质量浓度为25 mg/mL时，与阳性对照组相比较，差异不显著（P＞0.05）；当质量浓度为50 mg/mL和100 mg/mL时，其OD值都极显著高于空白对照组（P＜0.01），说明蓝莓花青素对脾淋巴细胞的增殖有促进作用，且随着花青素质量浓度的增大和培养时间的延长而增强。

图8 蓝莓花青素对小鼠 脾细胞增殖活性的影响Fig.8 Effects of blueberry anthocyanins on splenocyte proliferation in mice

TNF-α和IL-2是两个重要的介导免疫反应的细胞因子[21]。图9和图10的结果表明，培养1d，阳性对照组和蓝莓花青素样品组的OD值与空白对照组无显著差异（P＞0.05）；培养2 d后，OD值显著高于空白对照组（P＜0.05）。可见，本工艺提取获得的蓝莓花青素不仅促进脾细胞增殖，同时能协同ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞分泌TNF-α和IL-2炎症因子。根据《保健食品检验与评价技术规范实施手册》[22]评判标准，初步判定本工艺提取获得的蓝莓花青素，具有增强免疫力功能。

图9 蓝莓花青素对脾细胞分泌IFFNN--α含量的影响Fig.9 Effect of blueberry anthocyan on IFN-α production

图10 蓝莓花青素对脾细胞分泌IL-2含量的影响Fig.10 Effect of blueberry anthocyanins on IL-2 production

3 结 论

蓝莓花青素最佳 提取工艺条件为酒石酸为酸化剂、乙醇体积分数74.6%～76.2%、料液比1∶6.6～1∶6.8（g/mL）、浸提温度52.5～53.4 ℃、浸提液pH 3.0～3.1、浸提时间144.8～148.5 min，此提取工艺参数范围内蓝莓花青素的提取率均能高于35 mg/g。最佳工艺条件下提取的蓝莓花青素仍具有促进小鼠脾细胞增殖及协同ConA促进小鼠脾细胞分泌TNF-α和IL-2活性。因此本研究为蓝莓花青素的提取加工与产品研发提供了科学指导。

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Optimization of Extraction Process and Evaluation of Immunomodulatory Activity of Anthocyanins from Blueberry

PAN Li-hua1,2, WANG Jian-fei1, YE Xing-qian2, LUO Jian-ping1,*
(1. School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China; 2. School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

A quadratic orthogonal rotary composite design was used to optimize the extraction of anthocyanins from blueberry with respect to five process parameters including ethanol concentration, material-to-liquid ratio, solvent pH, temperature and time, and the proliferative effect of the extracted anthocyanins on spleen cells as well as the synergistic effect when combined with ConA on promoting the secretion of interferon-a (IFN-α) and interleukin-2 (IL-2) in mouse spleen cells was evaluated by in vitro cultivation. The results showed that the extraction efficiency for blueberry was significantly affected by ethanol concentration, material-to-liquid ratio, temperature and time. The optimal extraction conditions were found to be 74.6%–76.2% ethanol as extraction solvent with a material-to-liquid ratio of 1:6.6–1:6.8 (g/mL) for 144.8–148.5 min of extraction at pH 3.0–3.1 and 52.5–53.4 ℃. Under these conditions, the yield of anthocyanidins extracted from blueberry was more than 35 mg/g. The blueberry anthocyanins could significantly promote the proliferation of spleen cells and cooperate with ConA to accelerate the production of TNF-α and IL-2 in normal mouse spleen cells in a dose-dependent way.

blueberry; anthocyanin; orthogonal rotation combination design; immunomodulatory activity

TS202.3

A

1002-6630（2014）02-0081-06

10.7506/spkx1002-6630-201402015

2013-04-28

安徽省2012年度科技攻关计划项目（1201032075）

潘利华（1973—），女，副教授，博士，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：panlihua@hfut.edu.cn

*通信作者：罗建平（1966—），男，教授，博士，研究方向为中草药与功能食品化学。E-mail：jianpingluo@hfut.edu.cn