鼠李糖脂/蔗糖酯辅助乙醇提取沙棘籽黄酮的工艺条件及初步鉴定

王昌涛，张佳婵，孙啸涛，池灵荷，孙宝国,*

（1.北京工商大学理学院，植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学食品学院，北京 100048）

鼠李糖脂/蔗糖酯辅助乙醇提取沙棘籽黄酮的工艺条件及初步鉴定

王昌涛1，张佳婵1，孙啸涛2，池灵荷2，孙宝国2,*

（1.北京工商大学理学院，植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；2.北京工商大学食品学院，北京 100048）

以沙棘籽粉为研究对象，在单因素试验的基础上优化鼠李糖脂或蔗糖酯辅助提取沙棘籽黄酮的工艺，同时对所得黄酮类物质进行初步纯化鉴定。结果表明：适当添加该两种表面活性剂可以提高沙棘籽黄酮的提取率；鼠李糖脂辅助提取法最优条件为体积分数65%乙醇、鼠李糖脂质量分数0.33%、液料比40∶1、提取温度80 ℃、提取时间1.5 h，提取率为（5.34±0.07）mg/g；蔗糖酯辅助提取法最优条件为体积分数65%乙醇、蔗糖脂质量分数0.02%、液料比60∶1、提取温度80 ℃、提取时间1 h，提取率为（5.91±0.11）mg/g；高效液相色谱分析发现所得黄酮物质组分上与传统醇提法无明显差异，用AB-8型大孔吸附树脂初步分离可以判断含有山奈酚。

沙棘籽黄酮；生物表面活性剂；醇提法；提取率

沙棘是一种兼具生态效益和经济效益的树种，我国现有沙棘林约130万公顷，沙棘籽年产量26.3万吨[1-3]。目前发现沙棘中的生物活性物质有200种之多，其中黄酮类为重要的活性成分，其主要集中于沙棘叶和沙棘果中，少量存在于沙 棘籽中[4-6]。目前，从沙棘中提取得到的黄酮类物质从结构上分为6类约32种，以槲皮素和异鼠李素黄酮醇为主。在临床研究中发现，黄酮类物质具有降低血清胆固醇、抗溃疡、抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗辐射、抗病毒、抗心衰、抗心肌缺血、抗心率失常等方面有明显的药理功效[7-12]，因此分离提取沙棘黄酮类物质具有重要的意义。

目前对于黄酮类物质的提取方法主要有传统的溶剂提取法、超临界萃取、酶法提取、微波萃取以及超声波提取法[13-17]。其中溶剂提取法是最常用的提取方法。将表面活性剂与活性成分（如黄酮类物质、生物碱及挥发油等不溶于水或不易溶于水的物质）提取工艺相结合是具有卓越意义的一步。表面活性剂可以降低表面张力，改变这些成分在水溶液中的溶解性，提高活性成分的提取效率，降低提取成本[18]。李金秀等[19]将表面活性剂应用于槐米中芸香甙的提取，相较于传统碱溶酸沉的提取工艺来说，该方法耗时短、提取率理想，提取成本降低。相较于化学表面活性剂而言，生物表面活性剂具有了更为优越的性能和安全性。本研究选定两种糖脂类生物表面活性剂鼠李糖脂和蔗糖酯作为研究对象，将其应用于沙棘籽黄酮的提取工艺中，通过实验优化改进工艺条件，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析沙棘籽黄酮成分，为以后工业生产提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘籽粉 青海康普生物科技有限公司。鼠李糖脂（3%水溶液）、蔗糖酯 北京迪朗生化科技有限公司；无水乙醇（分析纯） 北京化工厂；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油醚（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；乙醇、乙腈（均为色谱纯） 赛默飞世尔科技有限公司；芦丁（纯度98%）、槲皮素（纯度97%）、儿茶素（纯度98%）、山奈酚（纯度97%）阿拉丁试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BS2202S型电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；DSHZ-300恒温水浴振荡器 江苏省太仓市实验设备厂；T6新世纪紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；1525高效液相色谱仪（配Waters 2707自动进样器、Waters 2489紫外检测器） 美国Waters 科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘籽粉的预处理

取干燥沙棘籽粉若干克置于500 mL圆底烧瓶瓶中，加入石油醚至没过沙棘籽粉，混匀，置于40 ℃的水浴锅回流1 h，冷却静置，抽滤后回收溶剂，滤渣置于通风处自然风干，即得到脱脂后的沙棘籽粉。

1.3.2 沙棘籽黄酮的测定及黄酮提取率的计算

标准曲线的绘制：精确称取120 ℃干燥至恒质量的芦丁标准品50 mg，无水乙醇定容至50 mL，超声后得到1 mg/mL的芦丁标准溶液。准确移取上述标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于25 mL容量瓶中，分别加入质量分数5% NaNO2溶液0.8 mL，摇匀，静置6 min；加入质量分数10% Al(NO3)3溶液0.8 mL，摇匀，静置6 min；加入1 mol/L NaOH溶液10.00 mL，用体积分数70%乙醇溶液定容至25.00 mL，摇匀后静置10 min，于510 nm波长处测定吸光度。以标准溶液的质量浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线。

样品测定：取样品液1 mL后操作同上节“分别加入质量分数5% NaNO2溶液0.8 mL”后。对照标准曲线得所提取总黄酮的质量浓度。

式中：C1为经标准曲线计算后得测试样品的质量浓度/（mg/mL）；V1为测定时溶液的定容体积/mL；V2为所取提取液的体积/mL；V为提取液的总体积/mL；m为称取样品的质量/g。

1.3.3 醇提法条件的确定

参考朱万靖[20]、刘树英[21]、赵文杰[22]等对沙棘黄酮的相关研究内容，总结得到最优提取工艺：乙醇体积分数65%、液料比40∶1、回流提取温度80 ℃、提取时间2 h。该条件下沙棘籽黄酮类化合物的提取率为8.06%。

本研究内容将在该醇提条件的基础上添加生物表面活性剂，以黄酮提取率为考察因素，探讨生物表面活性剂对提取黄酮类物质的影响。

1.3.4 生物表面活性剂的影响

固定乙醇体积分数65%、液料比40∶1、提取温度80 ℃、提取时间2 h，将提取液真空浓缩，添加溶剂无水乙醇5 mL，混匀静置1 h，15 000 r/min离心10 min，取上清液测定总黄酮含量，计算提取率。设置3组平行，以此为空白对照。在此基础上，分别添加质量分数0.7%鼠李糖脂和质量分数0.02%蔗糖酯，探讨这两种生物表面活性剂对黄酮提取率的影响。

1.3.5 生物表面活性剂对沙棘籽黄酮提取率影响的单因素试验

1.3.5.1 鼠李糖脂辅助法

设定鼠李糖脂质量分数0.67%、乙醇体积分数65%、液料比50∶1、提取时间60 min、提取温度80 ℃。固定其他条件，分别探讨鼠李糖脂添加量（质量分数0.33%～2.97%，下同）、液料比（10∶1～80∶1）、提取温度（50～90 ℃）、提取时间（0.5～2.5 h）对总黄酮提取率的影响，其余操作同1.3.4节。

1.3.5.2 蔗糖酯辅助法

设定蔗糖酯质量分数0.03%、乙醇体积分数65%、液料比50∶1、提取时间60 min、提取温度80 ℃。固定其他条件，分别探讨蔗糖酯添加量（质量分数0.015%～0.135%，下同）、液料比（20∶1～90∶1）、提取温度（50～90 ℃）、提取时间（0.5～2.5 h）对总黄酮提取率的影响，其余操作同1.3.4节。

1.3.6 HPLC分析沙棘籽黄酮

1.3.6.1 AB-8大孔吸附树脂初步纯化沙棘籽黄酮

参考王建国等[23]的研究，本实验中选用AB-8大孔树脂对沙棘籽黄酮进行纯化。最佳工艺条件为吸附时间30 min，60%乙醇4倍树脂体积解吸附，流速为5 mL/min。

大孔吸附树脂的预处理：将AB-8型大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，用蒸馏水反复冲洗至水无白色浑浊为止，再用4 BV的体积分数5%盐酸溶液以3 BV/h的流速通过树脂层，浸泡3 h，蒸馏水以同样流速洗至溶液呈中性；最后用4 BV 5 g/100 mL氢氧化钠溶液以3 BV/ h的流速通过树脂层，浸泡3 h，蒸馏水以同样流速洗至溶液呈中性。

纯化过程：取经过预处理的AB-8大孔吸附树脂湿法装柱，调节上样流速和流出速度均为1 mL/min，取15 mL 80 mg/mL的沙棘黄酮溶液上柱后用4 BV蒸馏水洗柱并收集流出液，测定流出液的吸光度。当吸光度不再改变时，说明已经吸附饱和，吸附饱和后以去离子水进行洗涤，1 mL/min收集流出液，直至流出液吸光度无变化为止。以60%乙醇为洗脱溶剂进行解析，观察解吸后流出的溶液颜色，当流出液颜色发生明显变化时，收集颜色最深的液体作为纯化后样品，进行下一步液相色谱的分析用液。

1.3.6.2 HPLC色谱条件[24]

Ultimate XB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；30 ℃柱温；检测波长254 nm；流动相：甲醇-水（35∶65）；流速1.0 mL/min；进样量10 øL。

1.3.7 进样液体制备

标准品溶液：精确称取儿茶素、槲皮素、芦丁和山奈酚标准品10 mg于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到1 mg/mL的4种黄酮标准品溶液。各吸取0.5 mL混匀置于样品瓶中，混匀，即得到0.25 mg/mL黄酮混合标准品溶液。

沙棘籽黄酮原液：通过表面活性剂辅助提取法提取得到沙棘黄酮粗品，将其溶于甲醇所得溶液为黄酮原液。

沙棘籽黄酮纯化后溶液：取AB-8型大孔树脂纯化后的解析液真空浓缩，溶于甲醇所得溶液为黄酮纯化后溶液。

2 结果与分析

2.1 生物表面活性剂的影响

表1 生物表面活性剂辅助提取试验结果Table1 Effect of two different surfactants on the extraction efficiency of flavonoids

经1.3.4节方法提取黄酮，由表1可知，添加一定量生物表面活性剂后，黄酮提取率有显著上升，鼠李糖脂辅助提取法获得的黄酮提取率达到（3.91±0.17）mg/g，是空白对照组的1.18倍；蔗糖酯辅助提取法获得的沙棘黄酮提取率达到（4.12±0.18）mg/g，是空白对照组的1.25倍。由此可见适当添加生物表面活性剂对沙棘籽黄酮类化合物的醇提有较为显著的辅助作用。付信宝等[25]将表面活性剂聚山梨酯20用于提取葛根总黄酮的工艺中，发现黄酮提取率有显著提高，且节能省时。董树国[26]、韩伟等[27]也证明了Tween 80、Tween 60亦可用于桑叶、墨旱莲中总黄酮的提取。

2.2 沙棘籽黄酮提取率的单因素试验

2.2.1 生物表面活性剂添加量对沙棘籽黄酮提取率的影响

图1 鼠李糖脂（A）和蔗糖酯（B）添加量对黄酮提取率的影响Fig.1 Effects of different amounts of added surfactants on the extraction efficiency of flavonoids

由图1A可知，鼠李糖脂添加量在0.33%到1.65%的范围内，黄酮提取率呈现先增高后降低的趋势。具体表现为0.33%～0.67%呈上升趋势，这可能因为表面活性剂添加量越大越容易形成胶束，胶束结构的形成有利于提高其增溶作用，在0.67%添加量时黄酮提取率达到最高，为（2.47±0.01）mg/g，添加量大于0.67%时逐渐下降，原因可能为表面活性剂的增大使得反应体系发生变化，醇溶性黄酮类物质在表面活性剂的作用下与水紧密结合不易分离。韩伟等[28]也在其研究中分析得到相似结果。因此从节省物料和保证提取率的综合因素考虑，选定鼠李糖脂的最适宜添加量为0.67%。

图1B显示了与图1A相似的变化趋势，蔗糖酯的研究范围为0.015%～0.075%，在添加量为0.03%时，黄酮提取率达到最大，为（5.22±0.05）mg/g。继续增大添加量后，提取率逐渐降低。原因可能是由于随着蔗糖酯添加量的增加，溶液黏度增大，使沙棘籽粉不能充分与提取剂接触，接触面积减小，导致黄酮提取率降低。由于鼠李糖脂和蔗糖酯的表面活性剂的亲水亲油平衡值等表面性质具有差异，所以两者所表现出的较优添加量也有不同。因此，选择蔗糖酯的较优值为0.03%。

2.2.2 液料比对沙棘籽黄酮提取率的影响

一般而言，液料比是传质推动力的直接体现，随着液料比的增大，传质推动力增大，整个溶媒的传质过程加快[29]。由图2A可知，鼠李糖脂辅助提取法提取沙棘籽黄酮时，随着液料比的增大，提取率呈现逐渐上升后逐渐稳定的趋势。液料比在10∶1～50∶1范围内提取率逐渐上升，从2.24～5.46 mg/g，此后提取率不再随着液料比的增大而增大。因此，从节省物料和保证提取率的综合因素考虑，选定液料比为50∶1，作为后续试验条件。

由图2B可知，随着液料比的增大，提取率逐渐上升随后趋势减缓。液料比在20∶1～60∶1范围内，提取率呈上升趋势，液料比为60∶1时达到5.49 mg/g，此后黄酮提取率上升不显著。因此，蔗糖酯辅助提取法选定最优液料比为60∶1。

图2 液料比对黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.3 提取温度对沙棘籽黄酮提取率的影响

由图3可知，随着提取温度的升高，鼠李糖脂辅助提取沙棘籽黄酮的提取率呈先升高后降低的趋势。在提取温度为50～80 ℃范围内，提取率随提取温度的升高而增大，并在80 ℃时，提取率达到最高，分析可能原因为温度升高加快了有效成分分子的运动速度，增加溶解量从而有利于提取效率；提取温度继续升高，沙棘籽黄酮提取率反而减低，原因可能是提取温度过高对表面活性剂乃至沙棘黄酮的结构造成了影响，以致影响了黄酮的提取及含量的测定。因此从节省物料和保证黄酮提取率的综合因素考虑，选定最优提取温度为80 ℃。蔗糖酯辅助提取法下不同提取温度对黄酮提取率的影响略有不同。随着提取温度的升高，沙棘籽黄酮提取率呈现升高趋势，并且无减小趋势，可见不同表面活性剂对黄酮提取效果显著不同。分析原因可能为鼠李糖脂和蔗糖酯虽然均为表面活性剂，但两者的分子质量、结构均有差异，在不同温度下所表现出来的表面性质也有不同，对于蔗糖酯辅助提取法而言，选定最优提取温度为80 ℃。

图3 提取温度对黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of flavonoids

2.2.4 提取时间对沙棘籽黄酮提取率的影响

图4 提取时间对黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on the extraction efficiency of flavonoids

由图4可知，鼠李糖脂辅助提取法随着提取时间的延长，沙棘籽黄酮提取率呈现先上升后下降的趋势，但总体趋势不显著。在提取时间为0.5～1.5 h范围内，提取率随提取时间的延长而增大，并在1.5 h时，提取率达到最高；提取时间继续增加，沙棘籽黄酮提取率反而有小幅度减低，但幅度不大，原因可能是提取时间过长导致醇溶性杂质溶于提取液中，与黄酮类物质竞争，因而降低了黄酮类物质的提取率。因此，选定最优提取时间为1.5 h。

蔗糖酯辅助提取法随着提取时间的延长，沙棘籽黄酮的提取率在4.73～5.03 mg/g范围内波动，但由于提取率在此范围内变化不明显，因此判断该因素为不影响因素，并从降低提取成本和保证沙棘籽黄酮提取率的综合因素考虑，选定最优提取时间为1 h。

2.3 正交试验设计优化沙棘籽黄酮提取工艺条件

根据单因素试验结果，分别对鼠李糖脂辅助提取法和蔗糖酯辅助提取法进行正交设计。选取对试验结果影响较大的3个单因素：A表面活性剂添加量、B提取温度和C液料比进行L4（23）正交设计。

表2 主体间因子设计表Table2 Factorial design

表3 主体间效应的检验Table3 Significant test

鼠李糖脂辅助提取法和蔗糖酯辅助提取法的主体间因子设计见表2。正交试验设计结果分析见表3。从表3可以看出，鼠李糖脂辅助提取法的各因素水平对试验结果影响的强弱顺序为：鼠李糖脂添加量＝提取温度＞液料比，其中液料比对提取率影响不显著（P＞0.1），提取温度和鼠李糖脂添加量对提取率影响极为显著（P＜0.05）；由表3分析得到鼠李糖脂辅助提取法各因素水平对提取率的影响，结果为A1＞A2，B2＞B1，C1＞C2。因此最佳工艺选取65%乙醇作为提取剂，鼠李糖脂添加量0.33%、液料比40∶1、提取时间1.5 h、提取温度80 ℃。从表2、3也可以得出蔗糖酯辅助提取法各因素水平对试验结果影响的强弱顺序：提取温度＞液料比＞蔗糖酯添加量，其中提取温度对黄酮提取率影响极为显著（P＜0.05），液料比对提取率的影响显著（P＜0.1），蔗糖酯的添加量对提取率影响不显著（P＞0.1）；各因素水平对提取率的影响结果为：A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1。因此蔗糖酯辅助提取法的最佳工艺选取65%乙醇作为提取剂，蔗糖脂肪酸酯质量分数0.02%、液料比60∶1、提取时间1 h、提取温度80 ℃。

2.4 优化条件的结果验证

将以上优化的反应条件进行3组验证实验，鼠李糖脂辅助提取法（提取剂65%乙醇、鼠李糖脂添加量0.33%、液料比40∶1、提取时间1.5 h、提取温度80 ℃）得到的提取率为（5.34±0.07）mg/g；蔗糖酯辅助提取法（提取剂5%乙醇、蔗糖脂肪酸酯的质量分数0.02%、液料比60∶1、提取时间1 h、提取温度80 ℃）得到的提取率为（5.91±0.11）mg/g，试验结果无明显差异，表明正交试验优化的工艺条件可行。

2.5 HPLC测定沙棘籽黄酮主要成分

图5 黄酮混合标准品（A）、醇提法样品（B）、鼠李糖脂辅助提取法样品（C）和蔗糖酯辅助提取法样品（D）在256 nm波长处的HPLC色谱图Fig.5 Comparative HPLC chromatograms at 256 nm of mixed authentic standards of flavonoids and flavonoids extracted with rhamnolipid and sucrose ester

图6 鼠李糖脂辅助提取法（A）和蔗糖酯辅助提取法（B）纯化样品在256 nm波长处的HPLC色谱图Fig.6 Comparative HPLC chromatograms at 256 nm of purified samples of flavonoids extracted with rhamnolipid and sucrose ester

在1.3.6.2节色谱条件下，标准样品及纯化后样品可以得到分离度较好的HPLC谱图（图5C与图6A，图5D与图6B）。图5中4种标准品儿茶素、芦丁、槲皮素和山奈酚的出峰时间分别为7.19、8.55、9.71 min和10.46 min。图5B为醇提法所得黄酮物质的HPLC谱图，对照图5C（鼠李糖脂辅助提取法）和图5D（蔗糖酯辅助提取法）发现，谱图形状和出峰时间未发现明显改变，进而说明两种表面活性剂辅助提取法所得物质与传统醇提法无较大差异，结构一致。经AB-8型大孔吸附树脂纯化后组分5出峰时间均为10.49 min，与山奈酚表现一致，因此初步判断组分5为山奈酚（图6），由于未配合进行质谱分析，所以所得结论有待进一步考究；出峰时间为6.5～8.5 min时组分未较好分离，一方面说明本实验所采用的文献中报道的高效液相色谱条件有待改善，另一方面也可以说明AB-8型大孔吸附树脂对沙棘籽黄酮有一定的分离和富集效果，由于本实验采用了文献方法并未对分离条件进行摸索，所以在今后研究可对进样浓度、进样量、pH值、流速、乙醇体积分数等因素中进行优化。

3 结 论

表面活性剂可以通过在其表面或界面的吸附作用或在溶液中形成的分子聚合体而改变黄酮类物质在水溶液中的溶解性，提高活性成分的提取效率、降低提取成本，具有省时、高效、节能的优点。本课题首次将鼠李糖脂和蔗糖酯应用到醇提沙棘籽黄酮的研究中，该两种生物表面活性剂可以显著提高沙棘籽黄酮的提取率，在传统醇提沙棘黄酮的方法基础上，摸索出了较为合适的提取条件：1）鼠李糖脂辅助提取法：乙醇体积分数65%、鼠李糖脂质量分数0.33%、液料比40∶1、提取温度80 ℃、提取时间1.5 h；2）蔗糖酯辅助提取法：乙醇体积分数65%，蔗糖脂质量分数0.02%、液料比60∶1、提取温度80 ℃、提取时间1 h。

对所得黄酮进行初步纯化和HPLC测定，醇提法所得黄酮与表面活性剂辅助提取法所得黄酮在结构上无明显差别，说明将表面活性剂应用与黄酮提取中可以保证产品的同一性。利用AB-8型大孔吸附树脂初步分离所得沙棘籽黄酮，可以初步判断含有山奈酚，但需要后续试验的进一步辅助分析。

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Optimization of Process Conditions for the Extraction of Flavonoids from Sea Buckthorn Seeds Using Ethanol Combined with Different Surfactants and Preliminary Characterization of the Extracte d Flavonoids

WANG Chang-tao1, ZHANG Jia-chan1, SUN Xiao-tao2, CHI Ling-he2, SUN Bao-guo2,*
(1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The extraction of flavonoids from sea buckthorn seeds using ethanol with different added surfactants, rhamnolipid or sucose ester was optimized by orthogonal array design method in the present study. Meanwhile, the extracted flavonoids were preliminarily purified and characterized. The extraction efficiency of flavonoids from sea buckthorn seeds was improved by addition of proper amounts of each surfactant. The optimal conditions for rhamnolipid-assisted extraction were extraction at 80 ℃ for 1.5 h using 65% aqueous ethanol as extractant with added 0.33% (mass fraction) rhamnolipid at a solvent-to-solid ratio of 40:1, resulting in a yield of (5.34 ± 0.07) mg/g. The optimal conditions for sucrose ester-assisted extraction were extractions at 80 ℃ for 1 h using an extractant consisting of 65% aqueous ethanol with added 0.02% sucrose ester with a solvent-to-solid ratio of 60:1, resulting in a yield of (5.91± 0.11) mg/g. The results of HPLC analysis showed that the flavonoid composition of both extracts obtained was not significantly different from that obtained with the traditional extraction procedure using ethanol alone. Kaempferol was separated by AB-8 macroporous resign chromatography from the two extracts obtained in this study.

sea buckthorn seed flavonoids; biosurfactant; ethanol extraction; extraction efficiency

TS202.3

A

1002-6630（2014）02-0062-07

10.7506/spkx1002-6630-201402012

2013-06-30

国家质检总局质检公益性行业科研专项（201310132）；北京市属高等学校人才强教深化计划中青年骨干人才培养计划项目（PHR20110873）

王昌涛（1975—），男，副教授，博士，研究方向为生物技术。E-mail：wangct@th.btbu.edu.cn

*通信作者：孙宝国（1961—），男，教授，博士，研究方向为食品香料与风味化学。E-mail：sunbg@btbu.edu.cn