回归正交试验优化超声波提取大麦中4种主要黄酮物质工艺

余春磊，袁金娥，张鹍飞，罗小娇，齐国昌，冯宗云*

（四川农业大学农学院植物遗传育种学系大麦研究中心，四川 温江 611130）

回归正交试验优化超声波提取大麦中4种主要黄酮物质工艺

余春磊，袁金娥，张鹍飞，罗小娇，齐国昌，冯宗云*

（四川农业大学农学院植物遗传育种学系大麦研究中心，四川 温江 611130）

通过一次回归正交试验，优选出大麦中4种主要黄酮类物质的最佳超声提取工艺。以儿茶素、杨梅素、槲皮 素和山奈酚的含量作为考察指标，以甲醇的体积分数、料液比和超声时间为试验因素，采用本课题组自行优化后的高效液相色谱检测体系对大麦中4种黄酮类物质的含量进行测定。结果表明：儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚在0.005～0.1 μg都呈良好的线性关系，测定方法稳定，可靠。优选超声提取的最佳提取条件为甲醇体积分数50%、料液比1∶20（g/mL）和超声时间60 min。

大麦；高效液相色谱法；儿茶素；杨梅素；槲皮素；山奈酚

黄酮类物质是植物第1大次生代谢产物，在植物的生长发育过程中起着重要作用，同时还具有清除自由基、抗衰老、防治心血管疾病等多种药物学功能[1]。大麦（Hordeum vulgare L.）是世界上第4大粮食作物，也是一种药食兼用的植物[2-4]。研究发现大麦中黄酮类物质含量丰富，具有花奎素、原飞燕草素B-3、花翠素等在其他禾本科中未含有的黄酮类物质[5]，但主要以儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚的形式存在[6]。有研究[7]表明这4种物质的总量占总黄酮的50%左右。

提取植物黄酮类物质的方法较多，如溶剂提取[8-10]、微波提取[11]、超声波提取法[12-13]、酶解法[14]、超临界流体萃取[15]、双水相萃取分离法[16]等。超声波提取法因操作简单，所提物质的结构不易被破坏[17-19]等优点，而被广泛用于植物次生代谢产物的提取测定[12-13]。目前大麦黄酮提取研究[20-21]较多，主要集中于总黄酮，王仙等[13]采用响应面分析法对超声辅助提取大麦籽粒总黄酮进行了优化，总黄酮提取率可达0.8 mg/g。但对大麦中主要黄酮类物质的提取与检测研究较少，仅杨涛等[6]和贺丹霞等[22]有少量报道，但这些研究都没有对4种主要黄酮类物质的提取方法进行优化且采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）进行检测时4种主要物质的得率较低、杂质峰较多、分离效果较差，因此本实验对4种黄酮类物质的超声提取进行优化，以期获得4种黄酮类物质超声提取的最佳工艺，从而为大麦黄酮的深加工利用和富含高含量黄酮大麦的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试大麦品种为94-19-1，由四川农业大学大麦研究中心提供。

儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚标准品（纯度≥98%） 上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈、冰乙酸为色谱纯 美国Fisher公司；实验用水为双蒸水，经0.45 μm滤膜过滤。

1.2 仪器与设备

1200型高效液相色谱仪 美国Agilent公司；AS20500B型超声波清洗机 厦门力天伟业科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大麦中4种黄酮类物质的提取方法

称取大麦籽粒适量，80 ℃烘干24 h，粉碎过60目筛，分别称取500 mg样品于不同的10 mL离心管，按不同料液比向每管加入一定体积的甲醇溶液，在超声清洗机中处理一定时间，提取液5 000 r/min离心8 min，将滤液转移至25 mL容量瓶定容至刻度，摇匀，然后用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取滤液作为供试溶液。

1.3.2 4种黄酮类物质的检测条件

在杨涛等[6]色谱条件的基础上，本课题组进行检测优化，优化后的色谱条件为色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：1%冰醋酸（A），乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～10 min，15%～30% B；10～16 min，30%～40% B；16～20 min，40%～15% B；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：280 nm；进样量：20 øL。

1.3.3 标准曲线及线性范围

准确称取烘干至质量恒定的标准品儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚各1 mg，用甲醇定容至10 mL，制成100 øg/mL的储备液作为对照品标准溶液，准确吸取各对照品标准溶液各50 øL定容至1 mL，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，以对照品进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4 仪器方法学考察实验

精密度：准确吸取儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚混合对照品溶液16 μL，按1.3.2节色谱条件重复进样6次，分析仪器的精密度。

重复性：按1.3.1节方法平行制备6份供试溶液，按1.3.2节色谱条件进样，分析实验的重复性。

稳定性：将供试溶液分别在室温放置0、2、4、6、8、10 h；按1.3.2节色谱条件进样，分析实验的稳定性。

1.3.5 加样回收率实验

称取已知含量的大麦样品6份，分别精确加入混合对照品溶液1 mL，按1.3.1节方法制备供试溶液，按1.3.2节色谱条件进样分析回收率。

1.3.6 4种黄酮类物质的单因素试验

研究以甲醇体积分数、料液比和超声时间为单因素，考察各因素对4种主要黄酮类物质提取率的影响，均提取1次。

1.3.7 一次回归正交设计

综合考虑单因素试验结果，采用一次回归正交设计法优选4种黄酮类物质的提取工艺，利用SPSS 19.0和Excel软件进行回归分析，以4种黄酮类物质的提取量为指标，考察甲醇体积分数、料液比和超声时间3个因素对4种黄酮类物质提取率的影响，一次回归正交设计的三因素三水平编码表见表1。

表1 一次回归正交设计因素水平编码表Table1 Coded levels for factors used in orthogonal array design

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

图1 4种物质标准品（A）和大麦样品中4种黄酮类物质（B）的色谱图Fig.1 Chromatograms of authentic standards (A) of catechin, myricetin, quercetin and kaempferol and sample (B)

在杨涛等[6]色谱条件的基础上，通过对色谱柱、流动相及配比等方面进行优化，优化后的儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚的色谱图峰形好，分离效果较好。儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚的洗脱时间分别约3.44、10.01、13.51、16.91 min。标准品和样品的色谱图如图1所示。

2.2 标准曲线和线性范围

分别精密吸收对照品溶液1、2、8、14、16、20 μL在1.3.2节条件下依次进样，以进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，回归方程及线性范围见表2。

表2 4种黄酮类物质的回归方程及线性范围Table2 Regression equations and linear ranges for four flavonoid compounds

2.3 实验方法的可靠性

表3 4种黄酮类物质的可靠性实验结果Table3 Reliability of the method for determining four flavonoid compounds

按1.3.4节方法分析，由表3可知，儿茶素的精密度、重复性和稳定性的相对标准偏差（RSD）分别为0.6%、1.9%和0.8%；杨梅素的精密度、重复性和稳定性RSD分别为0.3%、0.9%和1.2%；槲皮素的精密度、重复性和稳定性RSD分别为1.2%、2.5%和2.3%；山奈酚的精密度、重复性和稳定性RSD分别为0.5%、3.7%和1.5%，表明仪器的精密度好，重复性较好，在10 h以内样品基本稳定，说明实验方法是可靠的。

2.4 加样回收率实验

表4 回收率实验结果Table4 Results of recovery tests

以1.3.5节方法进行分析，结果见表4，儿茶素的平均回收率为95.59%，RSD为3.36%；杨梅素的平均回收率为95.78%，RSD为5.40%；槲皮素的平均回收率为98.89%，RSD为3.02%；山奈酚的平均回收率为100.75%，RSD为2.46%；4种黄酮类物质的平均回收率在2.46%～5.40%，说明实验方法可行。

2.5 单因素试验

2.5.1 甲醇体积分数对大麦中4种黄酮类物质提取量的影响

图2 甲醇体积分数对4种黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of methanol concenration on the extraction efficiency of four flavonoid comounds

以料液比1∶40、超声时间30 min，其他条件保持不变，分别以甲醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%、100%提取4种黄酮类物质，考察甲醇体积分数对4种黄酮类物质提取量的影响，结果见图2。

如图2所示，随着甲醇体积分数的增大，4种黄酮类物质的提取量逐渐增加，当甲醇的体积分数达到60%时，4种黄酮类物质的提取量达到最大，之后除槲皮素提取率在甲醇体积分数70%～80%范围略有增加外，随着体积分数的增大，4种黄酮类物质都呈下降趋势，到甲醇体积为100%时，4种黄酮类物质的提取量降到最低，可能与溶出的一些亲脂性成分、色素等物质与4种黄酮类物质竞争所致，与段中华等[20]研究结果相似，故选择体积分数60%的甲醇溶液为提取溶剂。

2.5.2 料液比对大麦中4种黄酮类物质提取量的影响

选取60%的甲醇溶液作为提取溶剂，其他条件同2.5.1节，分别以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）对大麦4种黄酮类物质提取量的影响，结果如图3所示，随着溶剂用量的增加，除儿茶素缓慢增加外，杨梅素、槲皮素、山奈酚的提取量减少，当料液比为1∶20时，儿茶素增加到最大，之后虽有少许的增加和减少，但都没有料液比为1∶20时的提取量大，而其他3种物质一直减少，到料液比为1∶30时趋于平缓，所以综合考虑选取料液比为1∶10。

图3 料液比对4种黄酮提取量的影响Fig.3 Effectof ratio of solid to liquid on the extraction efficiency of four flavonoid compounds

2.5.3 超声时间对大麦中4种黄酮类物质提取量的影响

图4 超声时间对4种黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of sonication time on the extraction efficiency of four flavonoid compounds

选取60%的甲醇溶液作为提取溶剂，料液比1∶10，其他条件同2.5.1节，分别考察超声15、30、45、60 min对大麦中4种黄酮类物质提取量的影响，结果如图4所示，随着超声时间的延长，先有一个平缓的降低，到30 min降到最低，之后又开始缓慢的上升，到45 min的时候达到了最大，之后除儿茶素和杨梅素缓慢下降外，槲皮素和山奈酚基本保持不变，故选取超声时间为45 min。

2.6 一次回归正交设计的试验方案结果分析

按1.3.7节试验编码因素的试验方案和结果见表5。

表5 三因素一次正交设计方案与结果Table5 Orthogonal array design and results

表6 儿茶素方差分析表Table6 Variance analysis of catechin

表7 杨梅素方差分析表Table7 Analysis of variance for myricetin

表8 槲皮素方差分析表Table8 Analysis of variance for quercetin

表9 山奈酚方差分析表Table8 Analysis of variance for kaempferol

由表6～9可以看出，失拟项不显著（P＞0.05），甲醇体积分数和料液比对大麦中儿茶素和山奈酚的提取量影响显著（P＜0.05），料液比对杨梅素和槲皮素的提取量影响显著，两因素之间的交互作用不显著，大麦中4种黄酮类物质的提取量与3个因素（含两两因素间的交互作用）之间的回归关系显著，R2分别为0.949、0.953、0.963、0.956，说明含两因素间交互作用的一次回归模型与实际情况拟合的较好。在此模型下儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚的回归方程分别为y=296.98＋3.01x1＋23.1x2＋13.47x3－0.24x1x2－0.22x1x3＋0.01x2x3；y=16.76＋4.79x1－7.60x2＋3.80x3－0.05x1x2－0.06x1x3＋0.43x2x3；y=－196.89＋8.99x1－4.67x2＋9.44x3＋0.24x1x2－0.15x1x3＋0.01x2x3；y=249.33＋0.41x1＋31.10x2+3.05x3－0.38x1x2－0.065x1x3－0.01x2x3。

大麦中4种黄酮类物质的最优提取条件为甲醇体积分数50%、料液比1∶20和超声时间60 min，各因素对4种物质影响的主次顺序依次为料液比＞甲醇体积分数＞超声时间。

3 结 论

该研究利用一次回归正交优化了从大麦中超声提取4种主要黄酮类物质的3个因素，得到回归模型，儿茶素、杨梅素、槲皮素和山奈酚的回归方程并确定最佳的提取工艺条件为甲醇体积分数50%、料液比1∶20、超声时间60 min，该方法准确，可靠，可应用于大麦中4种黄酮类物质的同时提取，为大麦中黄酮类物质的深加工提供了强有力的技术支持。

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Optimizing an Ultrasound-Assisted Method for Extraction of Four Major Flavonoids in Barley by Using Orthogonal Regression Design

YU Chun-lei, YUAN Jin-e, ZHANG Kun-fei, LUO Xiao-jiao, QI Guo-chang, FENG Zong-yun*
(Barley Research Center, Department of Plant Genetics and Breeding, College of Agronomy, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China)

This study was attempted to develop the optimum ultrasound-assisted extraction (UAE) process of the four major fl avonoids catechin, myricetin, quercetin and kaempferol from barley using orthogonal array design and linear regression. The contents of these fl avonoid compounds in extracts were investigated with respect to methanol concentration, solid-tosolvent ratio and sonication time. We proposed an optimized high performance liquid chromatography (HPLC) system to determine the fl avonoids. The analytical method displayed a good linear relationship for all the compounds tested in the range of 0.005 - 0.1 μg, and was stable and reliable. The optimum extraction conditions were found using an extraction solvent consisting of 50% methanol in water with a solid-to-solvent ratio of 1:20 (g/mL) and sonication for 60 min.

barley; HPLC; catechin; myricetin; quercetin; kaempferol

TS210.4；S512.3

A

1002-6630（2014）02-0051-05

10.7506/spkx1002-6630-201402010

2013-04-09

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-05）

余春磊（1989—），男，硕士研究生，研究方向为大麦品质遗传育种与分子生物学。E-mail：564452862@qq.com

*通信作者：冯宗云（1963—），男，教授，博士，研究方向为大麦遗传育种与分子生物学。E-mail：zyfeng49@126.com